Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Immuno-elektronmikroszkópos módszer

Immuno-elektronmikroszkópos módszer

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok kombinálása szerológiai meghatározással lehetővé teszi a vírusok pontos azonosítását, illetve rendszertani helyük megállapítását, rokonsági körük felderítését. Az immunosorbent electron microscopy (ISEM) technikát akkor alkalmazzuk, ha a víruskészítményben olyan alacsony a virionok koncentrációja, hogy hagyományos negatív festéssel nem detektálhatóak (Milne és Lesemann, 1984; Dijkstra és De Jager, 1998). A módszer előnye a fajlagosság és az érzékenység növelése. A rácson lévő szenezett hártyára antitesteket kötünk, majd inkubáljuk a vírustartalmú szuszpenzióban. Az antitestek megkötik az antigenikusan közelálló rokon vírusokat. A rácsterületre számított részecskeszám-növekedés a szerológiai reakció nélküli mintákhoz képest 2000–10 000-szeres is lehet.

Az antitest és az antiszérum hígítása

A negatív festéshez hasonlóan 400 mesh, Formvar vagy Parlodion hártyával bevont, szenezett rácsot használunk. Az antiszérum-, vagy antitest-készítmény hígítása általában 1:1000, illetve 1:5000 arányban ajánlott. Kisebb hígítás (pl. 1:100) esetében az antigén (vagyis a virionok) kötődése gátolt az IgG és az egyéb szérumfehérjék között kialakuló, a kötőhelyekért folyó versengés miatt. Az antiszérum és egyben a víruskészítmény hígítására többféle puffer alkalmas. Sok esetben jó a 0,1 M-os, semleges foszfát-puffer, de a 6,0–8,0 közé eső pH-optimumot be kell állítanunk. 0,05 M-os Tris-HCl-oldat (pH 7,2–7,5), vagy az ELISA-tesztben is használt 9,6 pH-jú nátrium-karbonát-puffer szintén megfelelő lehet. Az antiszérummal történő inkubációhoz öt perc elegendő. Erősebb kötődést érünk el, ha az inkubációt nem szobahőmérsékleten, hanem 37 °C-on végezzük; ez a negatív festék jobb eloszlását is elősegíti. A vírusok kivonásához, a gazda–vírus kapcsolat típusától függően, különböző puffereket használhatunk. Bizonyos növényeknél nyers kivonat készítésekor szükség lehet különböző védőanyagok hozzáadására. Ezzel részben elkerüljük a növény gátló, vagy roncsoló komponenseinek károsító hatását. Kínai kelből (Brassica pekinensis) tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) kinyerésekor a szövetnedvhez 0,1 M EDTA-t, szilvából vagy kajszibarackból történő szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kivonása esetében 2,5%-ban nikotint kell tennünk. Egyéb vírusoknál még 2%-os polivinil-pirrolidon (PVP) vagy 1%-os polietilén-glikol (PEG) hozzáadása is lehetséges.

A kontrasztosítás

A kontrasztosításnak három alapvető módja van: 1. árnyékolás platina/palládiummal; 2. pozitív festés etanolos uranil-acetáttal és 3. negatív festés, amely az előbbi kettővel szemben olyan előnyös tulajdonságokkal rendelkezik, hogy a növényi vírusdiagnosztikában már szinte kizárólag a negatív festést alkalmazzák. Az aspecifikus reakciók kizárása és a tiszta háttér biztosítása érdekében a befejező fázist kivéve (kontrasztosítás) minden egyes lépés után mossuk át a rácsot a hígításnál használt pufferral vagy desztillált vízzel. Ez úgy történhet, hogy valamilyen tiszta felületre (például parafilmdarabka, Petri-csésze) kevés folyadékot (puffer vagy desztillált víz) cseppentünk, majd óvatosan belemerítjük vagy ráúsztatjuk a gridet. Végül a negatív festéket felvisszük a rácsra, rászárítjuk, és ezzel hozzáfoghatunk a minta elektronmikroszkópos vizsgálatához.