Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei

Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei

A növényi szövet tartósításával, megtartásával a virionokat sejten belüli környezetükben tanulmányozhatjuk (Kay, 1961). Az elektronmikroszkóp felbontóképességének köszönhetően sokkal részletgazdagabb képet kapunk a fertőzés okozta tünetekről. A gyantába ágyazott mintából bármikor készíthetünk metszeteket (Martelli és Russo, 1984), amelyeket szintén tárolhatunk és később újra vizsgálhatunk. Citokémiai módszerek alkalmazásával nyomon követhetjük egyes anyagcseretermékek sejten belüli elhelyezkedését, vagy megállapíthatjuk adott képletek (például zárványok) kémiai természetét.

A növényi szövetminta megválasztása

A vizsgálati anyag megválasztásánál tekintetbe kell vennünk, hogy szisztemikusan vagy lokálisan fertőzött növénnyel dolgozunk-e, meg kell különböztetnünk a tünetes és a (látszólag) tünetmentes, illetve a különböző szintről vett leveleket. Figyelnünk kell arra, hogy a minták a lehetőségekhez mérten eléggé homogének legyenek, tehát például sötétzöld-világoszöld mozaik esetén egy mintába vagy csak a sötét, vagy csak a világos területből kerüljön a szövet. Érdemes a növényt mintavétel előtt sötétben tartani, hogy a kloroplasztiszok keményítőtartalmát csökkentsük (ilyenkor az egészséges kontrollnövényt is sötétben kell tartani).

Fixálás

Célja, hogy a szöveten, sejten belüli alkotóelemeket a mintavételkor fennálló állapotukban rögzítsük és a sejt szerkezetét a legkevésbé drasztikus beavatkozással megőrizzük. A fixáló oldat és a fixálás körülményeinek meghatározásakor több tényezőt kell számításba venni. Problémát okozhat a kristályos aggregátumok, zárványok jelenléte, ilyen esetben speciális fixálást kell alkalmazni.

A fixálók úgy működnek, hogy bizonyos molekulák között keresztkötéseket hoznak létre. Ehhez először be kell jutniuk a sejt belsejébe, ami kémiai természetüktől függően gyorsan vagy lassabban történhet. Minél később alakulnak ki a kereszthidak, annál nagyobb a valószínűsége a műtermék keletkezésének. Ezért először előfixálást kell végezni egy aldehid típusú anyaggal, amely aránylag gyorsan bejut a sejtbe, és a fehérjemolekulák között, illetve a molekulákon belül képez keresztkötéseket.

A következő aldehideket használják általánosan fixálóként: glutáraldehid, formaldehid, akrolein, glutáraldehid és formaldehid keveréke (Karnovsky-féle fixáló). A glutáraldehid előnye, hogy gyorsan létrehozza a keresztkötéseket, jól megőrzi a citoplazma és a sejtalkotók szerkezetét, viszont lassabban hatol be a szövetekbe. A fixálást szobahőmérsékleten, 3–6%-os glutáraldehid koncentrációjú, 0,05–0,1 M foszfát- vagy kakodilát-pufferben, semleges pH-n végezzük. A nagy tisztaságú oldatot felhasználás előtt tartsuk hidegen és sötétben. A formaldehid reverzíbilis metilén-hidakat alakít ki. Önmagában kizárólag enzimatikus vizsgálatokra használják, glutáraldehiddel keverve kitűnő fixálószer.

A következő lépés az utófixálás, amihez leggyakrabban ozmium-tetroxidot használnak. Ez az oldat lassabban jut be a sejtekbe, és ott a telítetlen lipidmolekulák között alkot keresztkötéseket, így a membránok láthatóvá tételéhez feltétlenül szükséges. 0,02–0,1 M (pH 7) kakodilát-, foszfát-, Veronal- vagy PIPES-NaOH-pufferban oldjuk, 1–2%-ban. Az ozmium-tetroxidot – mivel gőzei erősen roncsolóak mind belélegezve, mind bőrön keresztül – tartsuk elszívófülke alatt. Bizonyos esetekben kálium-permanganáttal végzik az utófixálást (2–5%-os vizes oldatban), ez azonban erélyes oxidálószer, ezért a citoplazmában található virionokat és riboszómákat is tönkreteszi.

A legáltalánosabban használt pufferek a következők: 0,1 M kakodilát-HCl, 0,2 M Na-foszfát, Millonig-féle Na-dihidrogén-foszfát. Ozmium-tetroxid oldásához használhatunk Veronal-acetátot és 0,05 vagy 0,1 M kakodilát- vagy foszfát-puffert.

A fixálás úgy történik, hogy a levéllemezből (vagy az adott növényi szervből) borotvapengével 0,5–1 cm2-es darabokat vágunk, majd egy csepp fixálóoldatban még kisebb, 1 × 1 × 1,5 mm-es mintákat készítünk. Fiolába tesszük őket, és annyi fixáló oldatot öntünk hozzá, hogy a szövetdarabkák belemerüljenek. Ha nem süllyednek le a minták, a szövetek közötti térben lévő levegőt vízlégszivattyú segítségével távolíthatjuk el. Az aldehides előfixálás 1–3 óráig tart szobahőmérsékleten. Ezután az aldehidmaradványokat pufferral mossuk ki a mintákból Pasteur-pipettával. Ozmium-tetroxiddal utófixálás következik 1–3 óra hosszat szobahőmérsékleten, vagy 4 °C-on egy éjszakán át. Desztillált vizes mosással (2–3-szor 1 órán keresztül) eltávolítjuk a maradék OsO4-ot.

Dehidratálás

A gyantába ágyazás előtt a szövetekből ki kell vonnunk a víztartalmat és az oldatot szerves oldószerre kell cserélni, mert a gyanták általában vízben nem oldódnak. A víztelenítés fokozatosan növekvő koncentrációjú aceton- (epoxi gyanták) vagy etanol- és propilén-oxid-oldat sorozattal történhet. Minden oldatban 10, de maximum 30 percig állhat a minta (máskülönben a lipidek kioldódnának). Etanolos dehidratálás során a koncentrációsorozat: 1 × 30 perc 20, 40, 60, 95%-os és 2 × 30 perc abszolút alkoholban.

Gyantába ágyazás

Metszet készítésére a puha növényi szövetek kevésbé alkalmasak, különösen, ha ultravékony metszeteket akarunk nyerni. A gyanták jobb tartást adnak az anyagnak és meghosszabbítják a minta eltarthatóságát. Kémiai természetüket tekintve a gyanták polimer vegyületek, beágyazásra is különböző típusúak alkalmasak. Három fő csoportjuk az epoxi-, a poliészter- és az akril-gyanták. Szobahőmérsékleten folyékonyak, magasabb hőmérsékleten polimerizálódnak. A folyékony gyantakomponensek összemérésekor, illetve formába öntésekor vigyázzunk, hogy az a bőrünkre ne kerüljön, mert ezek általában rákkeltő anyagok. Az epoxi típusú gyanták közé tartoznak az Epon, az Araldit és a kettő keveréke. Ebben az esetben etanolos víztelenítés után 2x30 percre propilén-oxidba tesszük a mintákat, majd propilén-oxid:gyanta 3:1 arányú keverékébe helyezzük. Végül friss, tiszta gyantát öntünk a formákba, amelyekbe megfelelő orientációval beletesszük a szövetdarabkákat. Kemencében az előírt hőfokon és ideig (30–40 °C-on, egy éjszakán át) hagyjuk megkeményedni (polimerizálódni) az anyagunkat. Manapság sok laboratóriumban szívesebben használnak ún. Spurr gyantát (vinil-ciklohexén-dioxid), mert egyszerűbb vele dolgozni, víztelenítésre pedig egyaránt alkalmazhatunk etanolt vagy acetont. Magasabb hőmérsékleten polimerizálódik (kb. 70 °C-on, minimum 8 órán át). Akril-gyanta például a glikol-metakrilát, amely vízben oldódó vegyület, ezért a víztelenítést nem szerves oldószerrel végezzük, hanem közvetlenül víz és gyanta keverékének sorozatával.

A minta metszése

Ahhoz, hogy a gyantába ágyazott mintáinkból (amelyet blokknak neveznek) megfelelő méretű és vastagságú metszeteket tudjunk készíteni, mikroszkóp alatt egy csonkagúla vagy piramis alakot kell kifaragnunk. Ennek célja részben az, hogy eltávolítsuk a fölösleges gyantát a minta fölött (és körül), másrészt ez az alakzat biztosítja, hogy jól metsződjön a minta és ne törjön le. A piramis oldalait határozott mozdulattal alakítsuk ki, hogy a sík felületek simák legyenek. A piramis csúcsát metsszük le úgy, hogy felülnézetből négyszög alakú lapot kapjunk. Ez a sík felület merőlegesen essen a mintánk síkjára vagy a levéldarabka lemezére, ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni. Ezzel a felülettel párhuzamosan fogjuk metszeni a blokkot. Ezt a műveletet érdemes gondosan elvégeznünk, mert nagyon sok múlik azon, hogy hogyan képeztük ki a vágási felületet, amely nem lehet nagyobb 0,5 × 0,5 mm-nél.

A következő lépés a minta metszése ultramikrotómmal. A készülékbe gyémánt- vagy üvegkést fogunk be, adott szögbe állítjuk. Ha nem áll rendelkezésünkre gyémántkés, vagy nem rendelkezünk elég gyakorlattal, üvegkést magunk is készíthetünk késtörő műszerrel. A késhez ún. „csónakot” kell készíteni, amelyet a késhez ragasztunk és vízzel töltünk fel. A kész metszetek a csónakban lévő víz felületére úsznak rá. Jó esetben a metszetek sorban egymás után, szalagszerűen összekapcsolódva jönnek le a késről. A metszeteket összetereljük egy fogpiszkálóból vagy gyufaszálból és néhány szál ecsetszőrből készített eszközzel, majd felszedjük a gridre (egyszerűen belemerítjük a rácsot a vízfelületbe). Választhatunk 300–400 mesh hártyázatlan rácsot, vagy nagyobb rácsméretű, 200 mesh hártyázott (és szenezett) gridet. Ha sikerült a metszeteket a rácsra juttatni, szűrőpapírral finoman leitatjuk a vizet.

Festés (kontrasztosítás)

A biológiai anyagok jellemzője, hogy nem eléggé szórják az elektronokat, ezért az elektronmikroszkópban kapott kép kontrasztszegény lesz. Különböző eljárásokkal megnövelhetjük az elektronszóródást, s ezáltal a kontrasztot. Nehézfémionokat tartalmazó oldattal megfestve a mintánkat nagyon jó eredményt érhetünk el. Kontrasztosítást végezhetünk a fixálás során, víztelenítés előtt vagy alatt, illetve a beágyazás és metszés után, magukon a metszeteken uranil-acetát, uranil-nitrát vagy egyéb urániumsók oldatával. Víztelenítés előtt 15 percre 0,5–2,0%-os vizes oldatba tesszük a mintákat. Víztelenítés alatt a 70%-os etanol- vagy acetonoldathoz 1%-ban uranil-acetátot adunk, vagy uranil-acetátra nézve telített oldatot készítünk, és 15 percig tartjuk benne a mintákat. A metszeteket úgy festjük, hogy vízben, vagy 50%-os etanolban telített uranil-acetát-oldatot készítünk, és 1 órát hagyjuk benne a mintákat. Metszetek esetében használhatunk ólomsókat is (ólom-citrát, -tartarát), de ezek oldatban hajlamosak a levegő CO2-tartalmával karbonátos csapadékot képezni. Leginkább bevált festési mód az uranil-acetát és ólom-citrát együttes alkalmazása, amit kettősfestésnek nevezünk.

A kettősfestés menete

  1. 50%-os etanollal 2%-os uranil-acetát-oldatot készítünk.

  2. A grideket a metszeteket hordozó felületükkel fölfelé 10 percre vagy 1 órára az oldatba helyezzük.

  3. 20–30 csepp 50%-os etanollal mossuk, majd száraz szűrőpapírra tesszük.

  4. Néhány darab szilárd NaOH-pasztillát Petri-csészébe rakunk, lefedjük hidrofób anyaggal.

  5. A hidrofób anyagra ólom-citrátot csepegtetünk.

  6. A cseppekre 2 percre ráúsztatjuk a grideket.

  7. CO2-mentes desztillált vízzel mossuk.

  8. A grideket szűrőpapíron szárítjuk.