Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

11. fejezet - Fénymikroszkópos festéses módszerek

11. fejezet - Fénymikroszkópos festéses módszerek

Fénymikroszkópos vizsgálatokat a növényvirológiában elsősorban akkor végzünk, ha valamely tünet, illetve a fertőzés hatására létrejött képlet jelenlétére vagy pontos elhelyezkedésére vagyunk kíváncsiak (Esau, 1968; de Zoeten, 1976; Christie és Edwardson, 1977, 1986; Schmidt, 1980; Matthews, 1981). Megfigyelhetjük például a kristályos zárványok durva morfológiáját, vagy azt, hogy mely növényi szövetekben találhatók (61. ábra). Módunk van arra is, hogy a festődés alapján megkülönböztessük a fehérjetermészetű zárványokat a nukleotid tartalmúaktól (19. táblázat). A trifán-kék, a narancs-zöld (O–G) pl. a fehérjetermészetű, a metilzöld-pironin a nukleinsavak megfestésére alkalmas (Dijkstra és De Jager, 1998). Elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményének kiegészítésére is lehetőségünk nyílik, ha ugyanabból az anyagból készítünk mintát a fénymikroszkópos analízishez is. A festési technika előnye, hogy olcsó, gyors és egyszerű munkára ad lehetőséget, ezenkívül a növényi szövet nagy területéből vehetünk mintát.

19. táblázat - A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző festések alkalmazásakor (Dijkstra és De Jager, 1998 után)

Festék

Sejtmag

Sejtmagvacska

Plasztidák

Citoplazma

Zárványok

Trifán-kék

világoskék

kékesfekete

színmentes

(a kloroplasz- tiszok zöldek)

színmentes

kékesfekete

Floxin-metil-kék

rózsaszín

rózsaszín-

viola

rózsaszín

színmentes

rózsaszín-viola

Metilzöld-pironin

kék

világosvörös

világosvörös

színmentes

rózsaszíntől

sötétvörösig

Azúr-A

kék

vörös-viola

színmentes

színmentes

rózsaszíntől és

vörös-violától

színmentesig

(proteinszerű

zárvány esetén)

Narancs-zöld (O-G)

narancs

zöld

sárgászöld

sárgászöld

zöldesbarna


61. ábra - A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N = sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége folytán]

A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N = sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége folytán]


A növényi minta előkészítése

Ennél az eljárásnál általában friss növényi szövetekből készítünk mintát, de bizonyos esetekben lehet formalinnal vagy glutáraldehiddel fixált szövetet használni. Friss anyagból nehezebb metszeni, fixálás során viszont sérülhetnek a zárványok. Készíthetünk epidermisznyúzatot finom, egyenes szárú csipesz segítségével. Ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni, bodzabélben rögzíteni tudjuk a levelet és borotvapengével vághatunk vékony szeletet. Ilyenkor a levél epidermiszét az egyik oldalról előzőleg el kell távolítani, hogy a festék be tudjon diffundálni a sejtekbe (a kutikula akadályozza a festék bejutását).

Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés)

Protein tartalmú zárványok festésére alkalmas (ilyenek a potyvirus fertőzések következtében kialakuló zárványok) (Dijkstra és De Jager, 1998).

A festés menete

A háromféle festékből (calcomine orange 2RS vagy direct orange 102, ill. 26 és Luxol brilliant green BL) külön-külön törzsoldatot készítünk. A törzsoldatokat szobahőmérsékleten korlátlan ideig tárolhatjuk.

  1. 1 g festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban oldunk, összekeverjük, majd leszűrjük.

  2. A törzsoldatokból és vízből egy kisméretű óraüvegen keveréket készítünk a következő arányban: 1 rész narancs festékhez 1 rész vizet és 8 rész zöld festéket adunk. A narancs és a zöld festék egymáshoz viszonyított aránya ettől eltérhet, de a víz a teljes térfogat 10%-a legyen.

  3. A mintát a festékben 5–10 percig inkubáljuk.

  4. A festékoldatot Pasteur-pipettával eltávolítjuk, majd 95%-os etanollal többször mossuk (egy-egy mosás 15–20 másodpercig tartson). Ezután kevés 2-metoxi-etilacetátot adunk hozzá.

  5. 5 perc elteltével csipesz segítségével felvesszük a mintát, tárgylemezre helyezzük, egy csepp rögzítőt (Euparal) teszünk rá, és óvatosan rányomjuk a fedőlemezt (hogy a szövet kisimuljon).

  6. A mintát olaj-immerziós tárgylencsével, kb. 1000-szeres nagyítással tanulmányozhatjuk.

Amennyiben zöld Luxol festékhez nem tudunk hozzájutni, magunk is előállíthatjuk, a következő módon: 2 g 1,3-di-orto-tolylguanidint (DOTG) oldunk 50 ml 0,7 M HCl-oldatban (3 ml 37%-os HCl-at vízzel 50 ml-re hígítunk), keverjük, majd átszűrjük szűrőpapíron. 3 g Guinea-zöld B (savas zöld 3-CI42085) festéket 50 ml vízben feloldunk. Az így kapott két törzsoldatot összeöntjük, keverés után szűrjük, és a csapadékot többször átmossuk vízzel. Végül a szűrőpapíron összegyűlt csapadékot (kb. 2,7 g) vákuum alatt 1–2 percig szárítjuk.