Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek
dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard
Mezőgazda Kiadó
Tartalom
Fénymikroszkópos vizsgálatokat a növényvirológiában elsősorban akkor végzünk, ha valamely tünet, illetve a fertőzés hatására létrejött képlet jelenlétére vagy pontos elhelyezkedésére vagyunk kíváncsiak (Esau, 1968; de Zoeten, 1976; Christie és Edwardson, 1977, 1986; Schmidt, 1980; Matthews, 1981). Megfigyelhetjük például a kristályos zárványok durva morfológiáját, vagy azt, hogy mely növényi szövetekben találhatók (61. ábra). Módunk van arra is, hogy a festődés alapján megkülönböztessük a fehérjetermészetű zárványokat a nukleotid tartalmúaktól (19. táblázat). A trifán-kék, a narancs-zöld (O–G) pl. a fehérjetermészetű, a metilzöld-pironin a nukleinsavak megfestésére alkalmas (Dijkstra és De Jager, 1998). Elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményének kiegészítésére is lehetőségünk nyílik, ha ugyanabból az anyagból készítünk mintát a fénymikroszkópos analízishez is. A festési technika előnye, hogy olcsó, gyors és egyszerű munkára ad lehetőséget, ezenkívül a növényi szövet nagy területéből vehetünk mintát.
19. táblázat - A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző festések alkalmazásakor (Dijkstra és De Jager, 1998 után)
Festék | Sejtmag | Sejtmagvacska | Plasztidák | Citoplazma | Zárványok |
Trifán-kék | világoskék | kékesfekete | színmentes (a kloroplasz- tiszok zöldek) | színmentes | kékesfekete |
Floxin-metil-kék | rózsaszín | rózsaszín- viola | rózsaszín | színmentes | rózsaszín-viola |
Metilzöld-pironin | kék | világosvörös | világosvörös | színmentes | rózsaszíntől sötétvörösig |
Azúr-A | kék | vörös-viola | színmentes | színmentes | rózsaszíntől és vörös-violától színmentesig (proteinszerű zárvány esetén) |
Narancs-zöld (O-G) | narancs | zöld | sárgászöld | sárgászöld | zöldesbarna |
61. ábra - A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N = sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége folytán]
![A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N = sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége folytán]](kepek/061-nvir.jpg)
A növényi minta előkészítése
Ennél az eljárásnál általában friss növényi szövetekből készítünk mintát, de bizonyos esetekben lehet formalinnal vagy glutáraldehiddel fixált szövetet használni. Friss anyagból nehezebb metszeni, fixálás során viszont sérülhetnek a zárványok. Készíthetünk epidermisznyúzatot finom, egyenes szárú csipesz segítségével. Ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni, bodzabélben rögzíteni tudjuk a levelet és borotvapengével vághatunk vékony szeletet. Ilyenkor a levél epidermiszét az egyik oldalról előzőleg el kell távolítani, hogy a festék be tudjon diffundálni a sejtekbe (a kutikula akadályozza a festék bejutását).
Protein tartalmú zárványok festésére alkalmas (ilyenek a potyvirus fertőzések következtében kialakuló zárványok) (Dijkstra és De Jager, 1998).
A festés menete
A háromféle festékből (calcomine orange 2RS vagy direct orange 102, ill. 26 és Luxol brilliant green BL) külön-külön törzsoldatot készítünk. A törzsoldatokat szobahőmérsékleten korlátlan ideig tárolhatjuk.
1 g festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban oldunk, összekeverjük, majd leszűrjük.
A törzsoldatokból és vízből egy kisméretű óraüvegen keveréket készítünk a következő arányban: 1 rész narancs festékhez 1 rész vizet és 8 rész zöld festéket adunk. A narancs és a zöld festék egymáshoz viszonyított aránya ettől eltérhet, de a víz a teljes térfogat 10%-a legyen.
A mintát a festékben 5–10 percig inkubáljuk.
A festékoldatot Pasteur-pipettával eltávolítjuk, majd 95%-os etanollal többször mossuk (egy-egy mosás 15–20 másodpercig tartson). Ezután kevés 2-metoxi-etilacetátot adunk hozzá.
5 perc elteltével csipesz segítségével felvesszük a mintát, tárgylemezre helyezzük, egy csepp rögzítőt (Euparal) teszünk rá, és óvatosan rányomjuk a fedőlemezt (hogy a szövet kisimuljon).
A mintát olaj-immerziós tárgylencsével, kb. 1000-szeres nagyítással tanulmányozhatjuk.
Amennyiben zöld Luxol festékhez nem tudunk hozzájutni, magunk is előállíthatjuk, a következő módon: 2 g 1,3-di-orto-tolylguanidint (DOTG) oldunk 50 ml 0,7 M HCl-oldatban (3 ml 37%-os HCl-at vízzel 50 ml-re hígítunk), keverjük, majd átszűrjük szűrőpapíron. 3 g Guinea-zöld B (savas zöld 3-CI42085) festéket 50 ml vízben feloldunk. Az így kapott két törzsoldatot összeöntjük, keverés után szűrjük, és a csapadékot többször átmossuk vízzel. Végül a szűrőpapíron összegyűlt csapadékot (kb. 2,7 g) vákuum alatt 1–2 percig szárítjuk.