Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

12. fejezet - A vírusok izolálása és tisztítása

12. fejezet - A vírusok izolálása és tisztítása

A vírusokról szerzett ismereteink lényegesen gazdagodtak, amióta lehetővé vált a virionok tisztítása, és ezáltal fizikai és kémiai szerkezetük feltárása. A tisztítási és elválasztási módszerek tökéletesedésével magas tisztaságfokú és jelentékeny mennyiségű anyagot lehetett a biofizikai és biokémiai vizsgálatok számára előállítani és a vírusszerológia számára alkalmassá tenni. Az izolálásra és tisztításra általános módszer nincsen, hiszen az alkalmazott eljárás minden esetben a vírusbeteg növénytől, a víruskoncentrációtól és elsődlegesen a kórokozó fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Mindezek ellenére vannak olyan alapvető eljárások és módszerek, amelyeket részleteiben ugyan módosítva, de minden vírus tisztításánál alkalmazhatunk (Dijkstra és De Jager, 1998; Foster és Taylor, 1998).

A virionok tisztítása fertőzött növényekből

A vírusok tisztítása elsősorban a virionok elkülönítését jelenti a növény más anyagaitól, míg más értelemben, pl. az osztott genomú (multikomponens) vagy a szatellit vírusok esetén az egyes viriontípusok elválasztását is jelenti. Nyilvánvaló, hogy első lépésként a tiszta, azaz a más vírusokat nem tartalmazó izolátumot a megfelelő körülmények megválasztásával fel kell szaporítani a számára legkedvezőbb (azaz a legnagyobb víruskoncentrációt biztosító) gazdanövényben. Ezt követi a növény sejtjeinek feltárása, a virionok kivonása, extrahálása. A feltárt vírusszuszpenziót több lépésben meg kell tisztítani a durva és a finomabb sejtalkotórészektől, és tömény állapotba kell hozni, azaz koncentrálni kell. Az így kapott vírusoldat további tisztítása elsősorban a virionok és a hozzájuk molekulatömegben és alakban hasonló anyagok különválasztását, vagy az egyes víruskomponensek elválasztását jelenti. A tisztítási folyamat végén a virionok tisztaságát és töménységét kell ellenőrizni és tárolásra alkalmassá tenni.

A vírusok biológiai tisztasága

A fertőzött növények az esetek nagy részében más vírusokkal vagy ugyanazon vírus eltérő törzseivel is fertőzöttek lehetnek. Alapvető követelmény, hogy a tisztításra váró anyag idegen kórokozót ne tartalmazzon. A biológiai tisztaságot a gazdanövénykör ismeretében olyan differenciáló vagy szeparáló (elválasztó) növényekkel biztosíthatjuk, amelyek csak a számunkra kiválasztott vírus gazdanövényei. A víruselválasztás egyes esetekben akár bonyolult rendszert is jelent, amelynek eredményeképp egy komplex fertőzés összetevői biztosan elkülöníthetők (lásd A vírusok differenciálása tesztnövényekkel c. fejezetet). A biológiai tisztaság legfontosabb követelménye a genetikai azonosság. A növényekből izolált vírusok általában genetikailag nem teljesen azonos populációt képviselnek, bennük eltérő törzsek, szerotípusok vagy mutánsok is előfordulhatnak. Megközelítő tisztaságú izolátumhoz úgy juthatunk, ha egy lokális gazdanövényt mechanikai módszerrel úgy inokulálunk, hogy csak kevés lézió fejlődjön ki. Egyetlen léziót (ami nagy valószínűséggel homogén populációt képvisel) kiválasztunk, és abból kiindulva új lokális gazdanövényt fertőzünk, majd ennek egyetlen léziójából kezdjük el az izolátum felszaporítását egy fogékony gazdanövényben. Egyléziós kultúra kialakítására nem minden esetben nyílik lehetőség. Egyes esetekben a fajlagos vektorátvitel nyújt lehetőséget a más kórokozóktól való elkülönítésre. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) például könnyen tisztítható más, mechanikailag átvihető vírusoktól, ha az izoláláshoz tripsz vektort használunk. Hasonló lehetőség kínálkozik a levéltetvekkel terjedő vírusok elválasztására is olyan komplexekből, amelyek többi tagjai levéltetvekkel nem vihetők át, vagy eltérő levéltetű-átviteli módszerrel (cirkulatív vagy nem-perzisztens módszer) terjednek.

A vírusok felszaporítása fogékony növényben

A vírusokat tisztításra elegendő mennyiségben kell előállítani. E célra olyan fogékony gazdanövény a legalkalmasabb, amelyben a lehető legnagyobb víruskoncentráció érhető el, gátló anyagokat (nyálkát, inhibitorfehérjéket) vagy nagymennyiségű fenolt nem tartalmaz, ami a feltárás során oxidálódva a labilisabb vírusokat inaktiválja. A növény levelei lehetőség szerint laza szerkezetűek, vízben gazdagok legyenek. Ellenkező esetben a kivonó oldattal többszöri feltárást kell végezni. Az esetek többségében a legnagyobb víruskoncentrációt a növények fiatal csúcsi levelei biztosítják. Ha csak lokális gazdanövények állnak rendelkezésre [például a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) esetében], akkor a tisztításhoz lényegesen nagyobb mennyiségű növényi anyagra van szükség (62. ábra).

62. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei Nicotiana knightiana (A) és Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth József szívessége folytán]

A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei Nicotiana knightiana (A) és Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth József szívessége folytán]


Lényeges szempont a vírusfelszaporítás körülményeinek jó megválasztása. A felszaporítás céljaira használt növény folyamatos növekedésű, harmonikus tápanyag-ellátottságú legyen. A magasabb szintű nitrogénellátás többnyire kedvez a nagyobb víruskoncentráció elérésének. Az alacsony hőmérséklet általában nem segíti a vírusok replikációját, s hasonlóképpen kerülni kell az igen magas üvegházi hőmérsékleteket is; mindkettő megváltoztathatja a gazdanövény reakciótípusát vagy mutációkhoz vezethet. Az árnyékolás, különösen nyáron, kedvező hatású, a víruskoncentráció nagyobb lesz, a lazább levélszerkezet pedig a feltárást segíti.

A felszaporításhoz legmegfelelőbb a 20–25 °C hőmérséklet, amelyet ellenőrzött körülmények között legjobban klímakamrákban biztosíthatunk. A felszaporított növényi anyag vírustisztításra akkor a legalkalmasabb, ha a víruskoncentráció a legnagyobb értéket éri el. Ennek ideje a gazda–vírus kapcsolattól függ, de általában a tünetek teljes kifejlődésével esik egybe. Tisztításra legalkalmasabbak a levelek, de egyedi esetekben a gyökerekből is történhet. A floémben lokalizálódó sárgaság típusú vírusok (luteovirusok) tisztításához elsősorban a levélereket használják.

A frissen összegyűjtött növények a legmegfelelőbbek a tisztításra. A hűtőszekrényben vagy fagyasztóládában történő tárolás lényegesen rontja a hatékonyságot, különösen labilis szerkezetű vírusoknál. A szisztemikus gazdanövény víruskoncentrációját vagy a tisztítás egyes lépéseinek hatékonyságát lokális gazdanövények inokulációival folyamatosan ellenőrizhetjük.

A feltárás és kivonás körülményei

A tisztításhoz olyan kíméletes eljárással kell a gazdanövény sejtjeit elroncsolni, hogy a virionok ne inaktiválódjanak, vagy ne denaturálódjanak. A feltárás történhet kis mennyiség esetén porcelán dörzsmozsárban, míg nagyobb tömegű anyag esetén általában késes homogenizálást alkalmazunk. A feltáráshoz feleslegben adott kivonó puffert használunk, amelynek összetétele a tisztítandó vírustól függ. Az oxidációs és más enzimfolyamatok visszaszorítása érdekében a feltárást alacsony (0–4 °C) hőmérsékleten kell végezni, amit jeges fürdővel, hűtött eszközökkel, illetve hideg szobában történő munkával érhetünk el. Egyes esetekben ajánlott a folyékony nitrogénben történő feltárás is.

A kivonó puffer kiválasztása a legfontosabb, hiszen ennek kémhatása a vírus stabilitása szempontjából döntő. Leggyakrabban 7,0 pH körüli, enyhén lúgos kémhatású puffereket használunk, de egyes virionok [például a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus)] csak savas közegben tárhatók fel. A túlságosan lúgos közegben ugyanis a nukleinsavak és a fehérjék közötti kötés fellazul, a virionok felduzzadnak, szétesnek. Az ionerősség megválasztása is a tisztítandó vírustól függ, általában ez 0,1–0,2 M közötti érték.

Adalékanyagokat használhatunk a virionok stabilitásának növelésére (Ca++), a fenoloxidáció elkerülésére (koffein, nikotin szulfát, polivinil-pirrolidon), más oxidatív folyamatok ellensúlyozására (aszkorbinsav, cisztein, tioglikolsav, dietil-ditiokarbamát), és a fehérje- vagy a nukleinsavbontó enzimek gátlására (proteináz-inhibítorok, bentonit). A szállítószövetekben felhalmozódott, nehezen feltárható vírusok esetében sejtfalbontó enzimekkel (maceráz, pektináz) növelhetjük a kitermelés hatékonyságát.

A vírusoldat szűrése

A vírusokat tartalmazó nyers növényi szövetnedv tisztításában az első lépés a szűrés. Géz, tüllháló (cheesecloth) igen alkalmas a legdurvább sejtmaradványok, rostok eltávolítására, bár a felületük sok viriont is megköthet. Alacsony koncentráció esetén a szűréskor visszamaradt rostokat még egyszer feltárhatjuk a kivonó pufferrel.

A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektől

A tisztítás lényege, hogy a szövetkivonatot lehetőség szerint minden, vírustól idegen szennyeződéstől, a lehető legkevesebb veszteséggel megtisztítsuk. A sötétzöld, zavaros szűrt nyers présnedv sok alakos elemet (kloroplasztiszt, sejtmagvakat, sejtfaldarabokat, a vakuólum zárványait, keményítőt stb.) tartalmaz. Alacsony fordulatú centrifugálással (5–6000 ford/perc) viszonylag rövid idő alatt a durvább és a nehezebb alakos elemek eltávolíthatók. Szerves oldószereket (kloroform, kloroform és butanol keveréke, széntetraklorid) tanácsos a centrifugálás előtt a présnedvhez adni, azzal jól összerázni, majd hűtés mellett állandóan keverni. Az apoláros szerves oldószerek a lipoproteideket és a klorofill nagy részét összegyűjtik. Ezeket az oldószereket néha már a feltárásnál is használjuk. A centrifugálás az emulziót elválasztja vizes és oldószeres fázisra, ez utóbbit eltávolítva a virionokat tartalmazó felülúszó tisztább, enyhén opálos, halványzöld lesz. (A barna szín oxidált fenolok jelenlétét jelzi, ajánlott ilyenkor redukáló szerek alkalmazása.) A szerves oldószeres tisztítást természetesen azoknál a vírusoknál nem lehet alkalmazni, amelyeknek külső lipoproteid vagy glükoproteid burkuk van (tospovirusok, rhabdovirusok). A szerves oldószerek alkalmazása esetenként tetemes veszteségeket okozhat.

A növényi fehérjék elkülönítése

A nyers, egyszer centrifugált szövetnedv sok növényi fehérjét tartalmaz. Hőkezeléssel ezek közül sok denaturálódik, kicsapódik, és így az oldatból alacsony fordulatszámú centrifugálással eltávolítható. Csak igen stabil vírusok [például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] tisztításánál alkalmazható a virionok károsodása nélkül. A hőkezeléshez hasonlóan a fagyasztás is alkalmas lehet a növényi fehérjék koagulálására. A fagyasztás és újrafeloldás e célból célravezetőbb, mint az egyszeri fagyasztás, de alkalmazása azzal a veszéllyel jár, hogy a tisztítandó vírus is inaktiválódik. A fehérjék kicsapása az oldat kémhatásának csökkentésével is történhet. Alacsony (pH 5,0 körüli) értéknél sok fehérje kiválik. Izometrikus vírusoknál ez bevált módszer, helikális vírusoknál [például a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] nem.

Régebben a fehérjék kisózását gyakran használták tisztítási célra. Legelterjedtebb a 0,4%-os ammóniumszulfátos kisózás, de a citoplazma és kloroplasztisz riboszómáinak elválasztására Ca++ és Mg++ sókat is alkalmaznak. Derítéssel a tisztítandó oldatból számos olyan anyag (fenolok, inhibitorok, ribonukleázok, zöld sejttörmelékek stb.) eltávolítható, ami a tisztítás folyamatát zavarja. E célra felületaktív anyagokat, leggyakrabban faszénport, bentonitot, Celit-et (tisztított kovaföld), Ca-foszfát gélt, vagy DEAE cellulózt használhatunk. Tekintettel arra, hogy az adszorpció a pH és az ionerősség függvénye, a derítés körülményeit úgy kell megválasztani, hogy a virionok ne kötődjenek meg a felületen. A derítéshez használt anyagot szűréssel vagy centrifugálással különíthetjük el. Derítésnek tekinthetjük azt az eljárást is, amikor az egészséges növény fehérjéivel szemben termelt antiszérumot keverjük a tisztítandó oldathoz. Ez esetben a gazdanövény fehérjéi specifikusan kicsapódnak a vírusoldatból.

A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítése

A szennyezőanyagoktól mentesített növényi szövetnedv nagy hígításban tartalmazza a virionokat, amelyeket az oldattól el kell választani (izolálni), illetve a vírusoldatot be kell töményíteni. E célra leggyakrabban a vírusok kémiai kicsapását vagy fizikai ülepítését (ultracentrifugálását) alkalmazzák.

A kémiai kicsapás lényege azonos a növényi fehérjéknél alkalmazott módszerrel. Izoelektromos pontjuk közelében a virionok (nukleoproteidek) kicsaphatók, pl. a pH megváltoztatásával, extrém (3–5 pH) értékeken. A kicsapódott virionok centrifugálással gyűjthetők össze. A módszer hátránya, hogy csak a vírus fizikai tulajdonságainak teljes ismeretében biztonságos, az irreverzíbilis hatások miatt. A kicsapásra ezért inkább nagyobb koncentrációjú sóoldatokat – leggyakrabban ammóniumszulfátot – használnak. Az első kisózásnál (20%) a növényi fehérjék nagy része kicsapódik a virionok viszont nem. A centrifugálás után a felülúszó sókoncentrációját növelve (40%) már a vírusok nagy része kicsapódik a virion inaktiválódása nélkül. A kicsapást lassan, fokozatosan, kevergetés közben, hidegen kell végezni. A művelethez kristályos sót vagy tömény oldatot egyaránt használhatunk. A virionok kíméletes kicsapását az igen elterjedt (szintén több lépcsős) polietilén-glikolos (Mt 6000) kezeléssel érhetjük el. Ez esetben a virionok hidrátburkukat vesztve ülepíthetők ki az oldatból, ami a kémiai kicsapáshoz hasonló folyamat.

A fizikai elválasztási módszerek közül az ultraszűrésnek, a mozgó határfelületű elektroforézisnek vagy ioncserélő és adszorbciós oszlopon történő elválasztásának alárendelt jelentősége van. A leggyakoribb és legeredményesebb a virionok ultracentrifugással történő ülepítése. A nagy (40 000 ford/perc feletti) fordulatszámú szögfejes ultracentrifugákban a virionok mintegy két óra alatt a cső aljára ülepíthetők. Az ülepítést feloldás (szuszpendálás) követi, általában 1/10, vagy 1/5-rész pufferben. Az oldásra használt puffer gyakran azonos a kivonó pufferrel, ionerőssége azonban lényegesen kisebb, gyakran tartalmaz virionokat stabilizáló Ca- vagy Mg-ionokat. Lényeges, hogy a csapadék oldása lassan (akár egy éjszakán keresztül) történjen, a teljes oldódásig. Az oldhatatlan maradékot kis fordulatszámú centrifugálással különíthetjük el. Gyakran az ultracentrifugálás és a kis fordulatszámú centrifugálás lépéseit megismételve magas tisztaságfokú (opálos) vírusoldatot (szuszpenziót) kapunk. Az ultracentrifugálás többórás ideje alatt a fehérje- és nukleinsavbontó enzimek károsítanak, ezért az alacsony hőmérsékletet tartósan biztosítani kell, a feloldásra használt puffert célszerű sterilezni.

A hosszabb, helikális vírusok (potyvirusok) virionjai sérülékenyek, az ultracentrifugálás alatt eltörhetnek. Kíméletes ülepítési mód, ha a centrifugacsövek aljára pufferben oldott, töményebb „cukorpárna”-réteget teszünk, ami lassítja a virionok ülepedését.

A vírusok tisztításában döntő fordulatot jelentett a kilendülőfejes centrifugák és a lineáris cukorsűrűség-gradiensek alkalmazása. Ezekben a centrifugákban a gravitációs erő hatására a virionok a centrifugacső azonos magasságaiban koncentráltan, ülepedési állandójuknak megfelelően, egy zónában helyezkednek el. Ha az ülepítéshez cukorsűrűség-gradiens oldatot használunk, a virionok egyre töményebb oldattal találják szembe magukat, ülepedésük lelassul, leáll. A centrifugálás befejezése után a vírusokat tartalmazó zónák egymástól elválnak. Kellő töménység esetén az egyes frakciók felső megvilágítással, sötét háttérben jól láthatók.

A nukleoproteid tartalmú frakciók a centrifugacső injekcióstűvel történő megcsapolásával, vagy UV-detektorral ellátott frakciószedő géppel összegyűjthetők. Az ülepedési állandók különbözősége alapján a multikomponens-vírusok azonos nagyságú, de eltérő tömegű virionjai egymástól elkülöníthetők, frakcionálhatók.

A cukorsűrűséggradiens-centrifugálás terméke a virionokat tartalmazó sűrű cukoroldat. Az oldatot újból szögfejes ultracentrifugában ülepíthetjük. Híg pufferoldattal szemben dializálva a cukor eltávolítható, polietilén-glikollal (Mt 20000) szemben végzett fordított dialízissel töményíthető. Az egyes frakciók pontosabb elkülönítését teszi lehetővé a cézium-kloridos (CsCl2-os), borkősavas vagy nátrium-bromidos gradiens-centrifugálás.

A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartása

A vírusok fizikai jellemzői közül a vírustisztítás szempontjából a legfontosabb az ülepítési állandó (szedimentációs koefficiens), amely a részecskék adott gravitációs térben történő ülepedési idejét jelzi. Egysége a Svedberg (1S = 1 × 10–13 cm s–1 dyn–1 = 0,1 ps, picosecundum), amit analitikai ultracentrifugában kísérletesen határoztak meg. Mértékét befolyásolja a virionok nagysága, alakja és sűrűsége, a közeg viszkozitása. Értéke 50S [szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus)] és 1000 S (rhabdovirusok) között van. Az ülepedési állandó ismeretében lehet megszabni az ultracentrifugálás idejét és az alkalmazott fordulatszámot.

A tisztított vírusoldat elvileg csak nukleoproteinből áll. A víruskoncentrációt UV-fényben állapítják meg, az oldat 220 és 300 nm közötti fényelnyelése (optikai denzitása, extinkció) alapján. Az extinkciós együttható (extinkciós koefficiens) egységnyi töménységű vírusoldatban mért, a vírusra jellemző (általában 2 és 10 közötti) érték (1 mg/ml vírusoldat 1 cm fényútnál mért extinkciója 260 nm hullámhosszon). A vírusok UV-abszorpciós spektruma nem vírusspecifikus, de jelzi a készítmény tisztaságát (63. ábra). A virionoldatok általában 260 nm közelében mutatnak abszorpciós maximumot, míg a minimumérték 240 nm-nél észlelhető.

63. ábra - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és nukleinsav abszorpciós spektruma [Francki és McLean, 1968 után]

A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és nukleinsav abszorpciós spektruma [Francki és McLean, 1968 után]


A fehérjék adszorpciós maximuma 280 nm-nél van (A280), a nukleinsavaknál a legnagyobb érték 260 nm-nél mérhető (A260). A két érték hányadosa (A280/A260) alapján következtethetünk a nukleinsav-tartalomra.

Csak stabil vírusok tarthatók hűtőszekrényben hosszabb ideig. Tartósítószerként mertiolátot vagy nátriumazidot is alkalmaznak, utóbbi azonban a szerológiai reakciókat zavarhatja. A tisztított vírus tartósítására használt puffert az adott helyzetnek megfelelően kell kiválasztani. Jó tárolást biztosít a fagyasztás és –20 °C-on való tárolás is, azonban a többszörös felengedés és fagyasztás tönkreteszi a virionokat. Egyes vírusok 50% glicerin hozzáadásával tartósíthatók. A tisztított vírusok legjobban folyékony nitrogénben vagy liofilezve tárolhatók.

Megjegyzés: A könyvben csak néhány víruscsoportra jellemző vírus tisztítása szerepel példaként. A virológiai irodalom azonban tisztítási módszerekben gazdag, célszerű az adott vírus tisztítása előtt ezekről tájékozódni. A legtöbb ismert vírus tisztítására útmutatást találunk Murrant és Harrison (1970–1988) C.M.I./A.A.B. Descriptions of Plant Viruses című sorozatában, továbbá Dijkstra és De Jager (1998), valamint Foster és Taylor (1998) vírusdiagnosztikai könyvében. Magyarul először a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) tisztításáról jelent meg közlemény (Horváth, 1972), majd ezt követően Balázs és Vassányi (1984) számolt be mintegy harminc vírus tisztítási módszereiről.

Stabil, egykomponensű RNS-vírus egyszerű tisztítása (Gooding és Hebert, 1967)

A stabil, egykomponensű vírusok közül a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a legismertebb növénypatogén kórokozó. A fogékony dohánynövényekben nagy koncentrációban, parakristályos formában van jelen. A tisztításra legalkalmasabbak a fiatal, mozaikos felső levelek. Merev, pálcika alakú virionjai 300 nm hosszúak és 18 nm vastagok. 95% fehérje és 5% (egyszálú, pozitív) ribonukleinsav alkotja. Tisztítás során a virionok gyakran aggregálódnak. A vírus tisztításának egyes lépései a következők:

  1. A frissen leszedett vagy fagyasztott leveleket késes homogenálóban (Waring blendor) feltárjuk. A feltáráshoz 125 g levelet és vele azonos mennyiségű (125 ml) kivonó (extrakciós) puffert (0,25 M Na2HPO4 és 5 mM Na2EDTA), 1 g aszkorbinsavat és 1 ml 2-merkaptoetanolt adunk.

  2. A kivonatot 25 ml kloroformmal emulgeáljuk, jól összekeverjük, majd az elegyet durva szűrőpapíron, tüll- vagy nejlonszöveten átszűrjük.

  3. A szűrletet centrifugálással (10 perc, 10 000 g) tisztítjuk, a felülúszót durva szűrőpapíron szűrjük át.

  4. 80 ml szűrlethez 10 ml 5 M NaCl-t és 10 ml 30%-os PEG-et (0,02 g Na-azidot tartalmazó 30%-os polietilén-glikol 6000) adunk kis adagokban, majd az oldatot 20 percig lassan kevertetjük.

  5. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (10 000 g) ülepítjük. A felülúszót elöntjük, az üledéket 10 ml oldó pufferben (hígított NaOH-val pH 7,6-ra állított 2 mM Na2EDTA) feloldjuk. Az oldathoz 3 ml kloroformot adunk.

  6. Centrifugálással (3 perc, 10 000 g) a fázisokat elválasztjuk, a felső, vizes fázist Pasteur-pipettával összegyűjtjük, a kloroformos fázist elöntjük.

  7. A tisztított vírusoldatot 1 órán át 150 000 g-vel ultracentrifugáljuk. A felülúszót elöntjük.

  8. A csapadékot az oldó pufferrel (e pont) feloldjuk, majd alacsony fordulatszám mellett centrifugáljuk (10 perc, 15 000 g).

  9. A tisztított vírusoldatot ultracentrifugában (1 óra, 150 000 g) újra ülepítjük.

  10. Az üledéket az oldó pufferben feloldjuk, mintegy 20 mg/ml töménységben.

Megjegyzés: A tisztított vírusoldat (1 mg/cm3) fajlagos fényelnyelése (abszorpciója) E260 = 3,0. Tároláskor a hűtőszekrényben lassan aggregálódik, ami a biológiai (RNS) vagy a szerológiai tulajdonságokra (fehérje) nincs hatással. 5% etilén-glikol jelenlétében –70 °C-on jól eltartható.

Bomlékony, egykomponensű RNS-vírus tisztítása (López-Moya, 1993)

A bomlékony egykomponensű RNS-vírusok közül a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) az egyik gazdasági szempontból legfontosabb kórokozó. Helikális, hajlékony, fonál alakú virionjai mintegy 700 nm hosszúak, törékenyek. A feltárás során elsősorban a szerológiai tulajdonságokat meghatározó köpenyfehérje (CP) N-végi szakaszai károsodnak, amelyek a virion külső részein helyezkednek el. A kíméletes feltárás érdekében proteinázkeveréket (cocktail) alkalmazva a CP különlegesen labilis része nem károsodik, megőrzi eredeti szerológiai tulajdonságait. A vírustisztítás lépései a következők:

  1. Mintegy 100 g fertőzött, fiatal levelet (Nicotiana benthamiana vagy N. clevelandii) kétszeres mennyiségű proteáz inhibitor „coctail”-t [(1 mM fenolmetil-szulfonil-urea (MSF), 2 mM EDTA és 20 mM Na-jódacetát)] tartalmazó pufferben, késes homogenálóban hidegen feltárjuk. A 0,18 M McIlvain-puffer (pH 7) 0,25% tioglikolsavat, 0,01 M Na-DIECA-t és 0,5 M ureát tartalmaz. A feltáráshoz egyharmad térfogat (30 ml) kloroformot adunk.

  2. Szűrés után a növényi nedvet alacsony fordulatszámú centrifugában (Sorvall GSA) 10 percig (6000 ford/perc) ülepítjük.

  3. A felülúszót T 30 rotorban (Beckman) 90 percig ultracentrifugáljuk (25 000 ford/perc) 4 °C-on.

  4. A kiülepedett vírusokat (0,2% 2-merkapto etanolt és 1,0 M ureát tartalmazó) 0,01 M citrát-foszfát-pufferrel (pH 7,0) hidegen, minimum két órán keresztül szuszpendáljuk, a kiindulási súly negyedének megfelelő (25 ml) mennyiségű pufferben.

  5. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (6000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

  6. A felülúszót Ti 50 rotorban (Beckman) 90 percig (25 000 ford/perc) hidegen ultracentrifugálva a virionokat kiülepítjük.

  7. A csapadékot egy éjszakán keresztül tized térfogat (10 ml) (0,01 M Na2EDTA-t tartalmazó) 0,1 M borát-pufferrel (pH 7,0) oldjuk.

  8. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

  9. A virionokat ultracentrifugálással ülepítjük (Beckman Ti 50 rotor, 25 000 ford/perc, 3 óra).

  10. Az összegyűjtött virionokat 1 ml 50 mM-os borát-pufferben (pH 8,2) oldjuk. A spektrofotometriás méréshez mintegy 50-szeres hígítást használunk. E260 = 2,4.

Többkomponensű, ill. multikomponens-vírusok tisztítása (Lane, 1986)

A többkomponensű rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) fogékony gazdanövényeiben (árpa, búza) nagy koncentrációban fordul elő. A víruskoncentráció a fertőzés után egy-két héttel a legnagyobb. A 30 nm átmérőjű izometrikus virionok 20% nukleinsavat tartalmaznak. A tisztított vírus osztott genomú, négy komponense van. Az azonos nagyságú, de eltérő nukleinsav-tartalmú virionok a tisztítás után cukorgradiens-centrifugálással elkülöníthetők. A vírustisztítás lépései a következők:

  1. A fertőzött szöveteket azonos mennyiségű kivonó pufferrel (0,5 M Na-acetát, 0,8 M ecetsav) késes homogenálóban (Waring blendor) homogenáljuk.

  2. A kivonattal és kloroformmal (0,2 ml/g szövet) emulziót készítünk, az oldatot összerázzuk.

  3. Alacsony fordulaton centrifugáljuk (10 perc, 5 000 g).

  4. A felülúszót durva szűrőpapíron átszűrjük, majd állandó kevergetés közben (harminc percig) 1/4 rész 30%-os PEG-et (30% polietilén-glikol 6 000 és 0,02% NaN2) adunk hozzá. Erős kicsapódás látható.

  5. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (5 000 g) összegyűjtjük. A felülúszót kiöntjük.

  6. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelő 0,2 ml mennyiségű desztillált vízzel oldjuk, és a folyadék térfogatának megfelelő 0,4 rész kloroformmal emulgeáljuk.

  7. Öt perces centrifugálás után (5 000 g) a felülúszóhoz újra 1/4 térfogatnyi, 30%-os polietilén-glikolt (PEG) és 1/20 térfogatnyi 5 M NaCl-t adunk, állandó keverés (30 perc) közben.

  8. Centrifugálás (10 perc, 5 000 g) után a felülúszót elöntjük.

  9. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelően grammonként 0,2 ml acetát-pufferben (0,05 M Na-acetát, 0,01 M ecetsav, 1 mM Na2EDTA, 1 mM MgCl2) oldjuk.

Megjegyzés: A rozsnok mozaik vírus fajlagos abszorpciója E260 = 5 mg. A kitermelés kb. 1 mg/g szövet. Az oldat –70 °C-on fagyasztva (5% etilén-glikol hozzáadásával) tartható el a legjobban. A módszer alkalmas más izometrikus vírusok [lóbab foltosság vírus (broad bean mottle bromovirus), tehénborsó klorotikus tarkulás vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus), tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] tisztítására is.

DNS-vírus tisztítása (Guilfoyle, 1986)

A DNS-genomú vírusok legismertebb képviselője a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus). Az izometrikus virionok 50 nm átmérőjűek. A köpenyfehérje 42 kD, a kétszálú, kör alakú DNS mintegy 8 kilobázis (kb) nagyságú. A gazdanövényköre szűk. A felszaporításra leggyakrabban a tarlórépát (Brassica rapa cv. Just Right) használják. Az inokulációt követő 1-2 hét a legalkalmasabb a vírustisztításra. A víruskoncentráció a fiatal, tüneteket mutató levelek sejtjeiben (citoplazmában) a legnagyobb, ahol zárványtestekben (inklúziók formájában) fordul elő. A tisztítás sikere rendszerint a zárványtestek feltárásától függ. A tisztítás 2–4 °C-on történik.

  1. A fertőzött szöveteket folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban vagy acélköpenyes Waring blendorban elporítjuk. Kioldás után a szöveteket a nyers súlynak megfelelő térfogatú, 0,75% nátriumszulfitot tartalmazó, 0,5 M foszfát-pufferrel (pH 7,2) feltárjuk, majd magas fordulaton tovább homogenáljuk még egy percig.

  2. A homogenátumot nyolc réteg tüllhálón és egy réteg nejlonszűrőn (Miracloth, Calbiochem) átszűrjük.

  3. A szűrlethez Triton X-100-at (2,5% koncentrációig) és 1 M ureát adunk, majd a szövetnedvet 10–16 órán keresztül keverjük. Az oldathoz az enzimfolyamatok gátlására proteáz inhibitor PMSF-et (fenilmetil-szulfonilurea) adhatunk.

  4. A kivonatot centrifugálással (7 000 g, 10 perc) tisztítjuk meg a durva szennyeződésektől. Az üledéket eltávolítjuk.

  5. A felülúszó ultracentrifugálásával (40 000 rpm, 1 óra, 45-Ti Beckman-rotorban) a virionok kiülepíthetők.

  6. A vírusokat is tartalmazó üledéket 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1mM EDTA és 2,5% Triton X-100 pufferrel feloldjuk.

  7. A szuszpenziót a durva szennyezésektől centrifugálással (7000 g, 10 perc) tisztítjuk meg, a virionok a felülúszóban maradnak.

  8. Újabb ultracentrifugálással (lásd e pont) a virionok újra kiülepíthetők.

  9. A csapadékot ionmentesített vízben oldjuk, 36% céziumklorid hozzáadása után 16–24 óráig 35 000 fordulaton 75-Ti Beckman-rotorban centrifugáljuk.

  10. A centrifugálás után a virionok határozott opaleszkáló réteget mutatnak a gradiens közepe táján, amit frakciószedővel vagy a centrifugacső lékelésével összegyűjtünk.

  11. A tisztított vírusoldatot dialízissel sómentesítjük 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA és 150 mM NaCl ellenében 24 órán keresztül, a dializáló oldat többszöri cseréjével. A cézium-klorid-gradiens helyett cukorgradiens is használható.

Megjegyzés: A kitermelés 1–10 mg vírus/kg levél.

Glükoproteid burkú vírus tisztítása (Tas et al., 1977)

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) az állatpatogén vírusokkal rokon. A növénypatogén vírusok nagy részétől egyrészt a glükoproteid burok megléte, másrészt a multikomponens RNS-genom kettős, részben pozitív, és részben negatív jellege (ambiszenz polaritás) különbözteti meg. A 70–100 nm átmérőjű, változékony, majdnem szférikus virionok nagyon bomlékonyak, a membránburok lipofil jellege kizárja a poláros oldószerek használatát, a tisztítást állandóan alacsony hőmérsékleten (3 °C-on) kell végezni.

  1. 60–100 g fertőzött (Nicotiana rustica, vagy N. benthamiana) levelet vákuumban infiltrálunk 0,01 M Tris, 0,01 M nátrium-szulfit és 0,1% cisztein-hidroklorid (pH 8,0) extrakciós pufferrel. A leveleket Waring Blendorban homogenáljuk alacsony fordulaton 30 másodpercig.

  2. A szövetnedvet gézen átszűrjük, centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk. Az üledék is sok vírust tartalmaz, ezért nem dobjuk el, hanem újra feltárjuk.

  3. A centrifugálás üledékét 200 ml szuszpenziós pufferrel (0,01M glicin, 0,1% cisztein-hidroklorid és 0,1 Na-szulfit, pH 7,9) oldjuk, és 1–2 órán keresztül állni hagyjuk.

  4. A harmadik kivonatot újra centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

  5. Az első (b pont) és a második centrifugálás (d pont) felülúszóit elkülönítve ultracentrifugáljuk (30 perc, 25 000 ford/perc, Spinco R30 rotorban), a virionokat kiülepítjük.

  6. Az üledéket 20 ml szuszpendáló pufferben (c pont) oldjuk, majd a tisztított szövetnedvhez 0,2–0,4 ml egészséges növény (N. rustica vagy N. benthamiana) fehérjéivel szemben készített antiszérumot adunk, a szövetnedvet állni hagyjuk egy órára.

  7. A fehérjeprecipitátumot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) eltávolítjuk, a felülúszót megtartjuk.

  8. A felülúszót 6 ml-es adagokban szuszpenziós pufferben készített 3–30%-os cukorsűrűség-gradiens tetejére rétegezzük, majd kilendülőfejes centrifugában (23 000 ford/perc, 45 perc, SW 25 Spinco rotor) ülepítjük.

  9. A vírustartalmú zónát összegyűjtjük, majd 25–50% cukorsűrűség-gradiensben újra 5–16 órán keresztül ultracentrifugáljuk (23 000 ford/perc).

  10. A virionokat szuszpenziós pufferrel hígítjuk, majd az oldatot 30 000 ford/perc fordulaton 1 órán keresztül ultracentrifugálva koncentráljuk.

Megjegyzés: A kitermelés 1 mg/100 g szövet. A tospovirusokhoz tartozó vírusok [Impatiens nekrotikus foltosság vírus (Impatiens necrotic spot tospovirus), földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus (groundnut ringspot tospovirus), paradicsom klorotikus foltosság vírus (tomato chlorotic spot tospovirus)] tisztítására Feldhoff et al. (1996) dolgoztak ki új módszert. Az extrakciós puffer 0,1 M Na2SO3-at tartalmazó 0,1 M foszfát-puffer (pH 6), a szuszpenziós puffer tizedannyi töménységű. Az ultracentrifugálás 30 000 fordulatszámon történik harminc percig, a cukorgradiens-centrifugálás 27 000 fordulatszámon, 2 órán át, 20–50%-os cukoroldatban. A végső koncentrálás 1 órán keresztül tart, 50 000 ford/perc mellett.