Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A vírusfehérjék izolálása és tisztítása

A vírusfehérjék izolálása és tisztítása

Korábban a vírus-köpenyfehérje aminosavsorrendjének megismerése állt a vizsgálatok homlokterében, ma azonban inkább a vírusgenom által kódolt összes fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének megismerésén van a fő hangsúly, amelyek célja a virionok felépítésének és működésének tanulmányozása, az antigénszerkezet megismerése. A továbbiakban csak a köpenyfehérje vizsgálatának főbb módszereit tárgyaljuk.

A vírusfehérjéket tisztított vírusokból izoláljuk. Általában a kivonásnak olyan módszereit kell alkalmazni, amely megvédi a fehérjék természetes (natív) jellegét és nem vezet a térbeli szerkezet módosulásához. Az alkalmazott módszer természetesen a vizsgálat céljától, és nem utolsósorban az adott vírus tulajdonságaitól függ. Az izolálás első lépése a fehérjék és más alkotórészek (nukleinsav) közötti kötések megbontása, majd a nemkívánatos szennyezőanyagok denaturálása és eltávolítása.

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg ecetsavas módszerrel (Fraenkel-Conrat, 1957)

  1. A vírus vizes oldatához (10–30 mg/ml) fokozatosan két térfogat hideg jégecetet adunk, az oldatot 30–60 percig állni hagyjuk, időszakonként felkeverjük.

  2. Az oldatot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) tisztítjuk meg a kicsapódott nukleinsavtól.

  3. A felülúszót 2–3 napig dializáljuk desztillált vízzel, a víz többszöri cserélésével. A dialízis során a fehérje kicsapódik, ahogy az oldat pH-ja az izoelektromos ponthoz közelít.

  4. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással összegyűjtjük, majd a fehérjét desztillált vízzel szuszpendáljuk. A pH-értéket híg lúggal (NaOH) fokozatosan 8,0-ra emeljük, majd az oldatot egy éjszakára állni hagyjuk, hogy a fehérje feloldódjék.

  5. Az oldhatatlan anyagokat (emésztetlen virionok, denaturálódott fehérjék) ultra-centrifugálással (10 0000 g, 1 óra) eltávolítjuk.

Megjegyzés: A kitermelés a vírus összetételének megfelelően mintegy 95%-os. A módszer alkalmas más tobamovirusok, valamint a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) és a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) köpenyfehérjéjének tisztítására is.

A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg kalcium-kloridos módszerrel (Yamazaki és Kaesberg, 1963)

Ismert, hogy a virionok magas sókoncentrációjú oldatban disszociálnak. A módszer alapja, hogy a kétértékű Ca-ionok a virionban a fehérjék és nukleinsavak közötti kötést megbontják.

  1. Dializáljuk a tisztított vírusoldatot 1 M CaCl2-oldatban (pH 6,3) 12 órán keresztül, 4 °C-on. Az oldat opaleszkálóvá válik.

  2. A precipitátumot (RNS) centrifugálással (2 500 g, 20 perc) eltávolítjuk és a tiszta, fehérjéket tartalmazó felülúszót pufferrel szemben dializáljuk.

Megjegyzés: A módszer kis módosítással alkalmas egyéb vírusok [lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle bromovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), az árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) (64. ábra)] köpenyfehérjéjének tisztítására is. Más vírusok [(tehénborsó klorotikus foltosság vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus), vad uborka mozaik vírus (wild cucumber mosaic tymovirus)] alkalikus közegben disszociálnak (Tsugita és Hirashima, 1972).

64. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei néhány gazdanövényen. A: Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum opulus [Horváth József szívessége folytán]

A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei néhány gazdanövényen. A: Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum opulus [Horváth József szívessége folytán]