Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása

A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása

RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióból

A vírusnukleinsavak (RNS vagy DNS) kivonása a vírus struktúrájának megbontása, roncsolása nélkül nem lehetséges, ezért a nukleinsav-kivonás mindig bizonyos mértékű veszteséggel vagy a nukleinsavak károsodásával jár. Az alkalmazott módszerek e veszteségek csökkentésére, illetve a nukleinsavak károsodásának megakadályozására irányulnak. A virion szerkezetének megbontása természetesen nagymértékben függ az adott vírus stabilitásától. A feltárás során a vírusnukleinsavak kémiai és biológiai épségét meg kell őrizni, óva egyrészt a denaturáló hatásoktól (alacsony vagy magas pH), másrészt a nukleinsavbontó enzimektől. A legtöbb nukleinsav-tisztítási módszer alapja a kétfázisú fenolos módszer, amely során detergenseket, nukleázinhibitorokat, fémkelátképző anyagokat használnak. Az alkalmazott módszerek lényege, hogy a feltárás minél rövidebb ideig tartson, és a fehérjéktől kétfázisú rendszerben a nukleinsavak elkülöníthetők legyenek. A nukleinsav-tisztítás centrifugálással, alkoholos kicsapással vagy szilárd fázison történő megkötéssel történik (Bruening, 1972).

Feltárás fenolos extrakcióval

A nukleinsavak feltárására leggyakrabban vízzel telített fenolt használnak, ami további víz (puffer) hozzáadásakor kétfázisú rendszert képez. A nukleinsavak nagy része a vizes fázisban marad, míg az opálos, fenolos fázis többnyire a kicsapódott fehérjéket tartalmazza. A két rendszer alapos összerázása után a frakciók egymástól centrifugálással elválaszthatók. Néha interfázis is kialakul, ami a fenolban nem oldott fehérjéket tartalmazza. Alacsony sótartalom mellett, 60–65 °C-on, interfázis nem alakul ki. Ha a kirázáskor kloroformot (kloroform és fenol 1:1 arányú keverékét) is használnak – ami javítja a tisztaságot –, akkor interfázis alakulhat ki. Ez 1% izoamil-alkohollal javítható.

A fenolos módszer gyakran akár 50% RNS-kinyerési veszteséget okoz, amit javítani lehet azzal, ha a fenolhoz krezolt keverünk. A vizes fázisból a nukleinsavak ultracentrifugálással kiülepíthetők. Ez az üledék azonban vírusfehérjéket is tartalmaz. Az üledék oldása és detergenssel történő kezelése után magas tisztaságfokú nukleinsavat nyerhetünk óvatos cukor- vagy céziumklorid-gradiens-centrifugálással. Ha a centrifugacsövek 1/4 részébe 25%-os cukoroldatot rétegezünk, a gyorsabban ülepedő nukleinsavak a sűrűbb cukorpárnába ülepednek, míg a kisebb ülepedési sebességű fehérjék a felső részben maradnak.

A nukleinsavak kicsapásának ismert módszere a savas közegben (0,05–0,1 M kálium-acetát, pH 5) kétszeres mennyiségű 95%-os alkohollal történő kicsapás 0 °C-on vagy 0 °C alatt. A kicsapott nukleinsav centrifugálással (10 000 g, 15 perc) összegyűjthető. A tisztított nukleinsav biológiai állapotát a fertőzőképesség megmaradásával ellenőrizhetjük (pl. lokális léziós gazdanövényeken).

Megjegyzés: A fenol maró hatású, a bőrön nehezen gyógyuló égési sebeket okoz. Az eljárás során védőszemüveg, gumikesztyű, köpeny használata kötelező. Fenolos extrakcióhoz üvegeszközöket használjunk.

Dohány mozaik vírus- (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-kivonás fertőzött levelekből, fenolos módszerrel (Schlegel, 1960)

  1. A növényi anyagot súlyának megfelelő 4-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenol és 1% nátrium-pirofoszfát (Na4P2O4) 1:1 arányú keverékével homogenáljuk 5 percig, hűtött eszközökkel. (Az egész kivonást ajánlott hideg szobában, 5 °C alatt végezni).

  2. A kapott emulziót 5 percig 6 000 fordulaton centrifugáljuk.

  3. A nukleinsavat tartalmazó vizes fázist 2-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenollal újra átrázzuk.

  4. A vizes fázisból a fenolmaradékot éterrel távolítjuk el, háromszor ismételve a kirázást.

  5. A nukleinsavakat 2 térfogatnyi hideg, 95%-os etanollal kicsapjuk.

  6. Az alkoholos oldatot 5 percig centrifugáljuk (6 500 ford/perc).

  7. A nukleinsavat tartalmazó csapadékot hideg, 1%-os K2HPO4-oldattal feloldjuk. (A fertőzőképesség ellenőrzésére kontrollként az 1%-os K2HPO4-ban homogenált levélszöveteket használhatunk.)

Megjegyzés: A fenti módszer egyéb vírusok [lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) (65. ábra), dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus), borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus)] esetében is fertőzőképes nukleinsavat eredményezett.

65. ábra - Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális tünetek Datura gigantea növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum peregrinum növény levelén [Horváth József szívessége folytán]

Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális tünetek Datura gigantea növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum peregrinum növény levelén [Horváth József szívessége folytán]


Javított (kloroform-fenol) módszer nukleinsavak (RNS és DNS) kivonására tisztított oldatból

  1. Egy rész konyhasóval telített fenolt fél térfogat vizes oldattal és egy térfogat kloroformmal Vortexben 10 percig keverünk, fél térfogatmintával (vírusszuszpenzió).

  2. A két fázist 2 perces centrifugálással mikrocentrifugában elválasztjuk. A szerves fázis a 8-hidroxikinolintól sárga színű, általában alul helyezkedik el. Ha a sókoncentráció magas, akkor a fázisok fordítva helyezkednek el.

  3. A vizes fázist összegyűjtjük és új csőbe tesszük. Ügyeljünk, hogy a vizes fázis interfázist és szerves oldószert ne tartalmazzon.

  4. A vizes fázist egy térfogat kloroformmal összerázzuk, majd az elegyet 2 perces centrifugálással szétválasztjuk. A tiszta kloroformos fázis alul marad.

  5. A vizes fázist tiszta kémcsőbe gyűjtjük.

  6. A vizes fázishoz 1/10 térfogat 3 M Na-acetátot (pH 7) és 2,5 tf 95%-os etanolt adunk. Vortex-szel keverjük, majd 10 percig jeges fürdőn állni hagyjuk. Kis mennyiségeknél a kicsapás egy éjszakán át tart, vagy –20 °C-on rövidebb ideig.

  7. A csapadékot mikrocentrifugával ülepítjük (min. 10 perc, 14 000 ford/perc). Tíz mikrogrammnál több nukleinsav már látható üledéket ad.

  8. Mikropipettával a felülúszót eltávolítjuk.

  9. Az üledékhez 500 mikroliter 80%-os etanolt adunk. Összerázás után 5 percig (14 000 ford/perc) centrifugáljuk, majd az alkoholt óvatosan elöntjük.

  10. Az üledéket vákuummal szárítjuk, míg az alkohol el nem párolog.

  11. A nukleinsavat steril vízben vagy pufferben oldjuk.

Vírus-DNS kivonása

A növénypatogén vírusok kisebb részében a genom DNS, és leginkább kétszálú. E vírusok jelentősége elsősorban abban van, hogy a magasabb rendű élőlények genetikai anyagával megegyező felépítésűek, így különösen alkalmas objektumai a molekuláris virológiai és a biotechnológiai kutatásoknak.

DNS-kivonás fenolos módszerrel (Shepherd et al., 1968)

A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) különösen stabil kapszidjait csak fenolos, vagy csak nátrium-dodecil-szulfátos (SDS, 2,5 mg/ml), vagy pronázos (50 µg/mg vírus) inkubálással bonthatjuk meg 37 °C-on (Shepherd et al., 1970).

  1. A tisztításhoz tisztított vírusoldatot használunk, amit 37 °C-on inkubálunk 6 órán keresztül 50 mM Tris-HCl-pufferben (pH 7,2) 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl és 500 µg/ml proteináz K jelenlétében.

  2. A proteázos emésztés után az oldathoz CsCl2-t teszünk, 0,78 g/ml végkoncentrációig, majd 300 µg/ml etidium-bromidot keverünk hozzá.

  3. A DNS-t ultracentrifugálással tisztítjuk (24 óra, 52 000 ford/perc 20 °C-on, Ti-75 Beckman rotorban). A DNS-zóna helyzetét UV-fényben láthatjuk, ezt a frakciót összegyűjtjük.

  4. Az etidium-bromidot 3 M CsCl2-dal telített izopropanollal ismételt kirázással távolítjuk el.

  5. A DNS-oldatot 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) és 1 mM EDTA-val szemben dializáljuk, az oldat többszöri cseréjével.

Megjegyzés: Ha az enzimes kezelés után a DNS-t fenol-kloroformos módszerrel választjuk el, a Sarkosyl helyett SDS-t használunk. Fenolos kivonásnál az enzimes feltárás után a kivonó pufferhez 1 mM etanolamint (pH 10,5) keverve a kitermelés javítható.

Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekből

Az egészséges növény szövetei a DNS és RNS mellett – ha kis mennyiségben is, de – kettős szálú ribonukleinsavakat (dsRNS) is tartalmaznak; néhány vírus genomja maga is dsRNS. A növénypatogén vírusok nagy része azonban egyszálú RNS (ssRNS), ami a replikáció során kétszálú formában fordul elő. Ez egy replikatív forma (RF), amely a pozitív genomi RNS-ből és annak negatív tükörképéből (template) áll. Az RF mellett azonban a fertőzött sejtekben olyan kettős szálú formák, a replikációs intermedierek (RI) is előfordulnak, amelyeken már egyszálú RNS-részek is vannak – ezek kisebbek, mint a RF. E szálakat azonban a tisztítás során az RNázok többnyire elemésztik.

A dsRNS-kivonás több módszerrel is lehetséges (cf. Jones, 1992): (1) a szövetek DNáz- és RNáz-kezelésével, (2) sóoldatban (pl. LiCl), eltérő oldékonyság alapján, (3) cukorsűrűség-gradiens centrifugálással, (4) cellulózról eltérő etanololdékonyság alapján. Morris és Dodds (1979) módszere egyesíti a fenti lehetőségeket. E módszer lényege, hogy az általában folyékony nitrogénben elporított szövetet olyan pufferrel tárják fel, ami az RNáz-aktivitást alacsony szinten tartja (magas pH, nagy sókoncentráció, detergensek, antioxidánsok és kelátképző anyagok). A nukleinsavak és fehérjék elválasztása általában kloroform és fenol keverékében történik, majd a nukleinsavakat cellulózporon választják el. A maradék, szennyező DNS-t és RNS-t enzimes emésztéssel távolítják el. Az így kinyert dsRNS-eket agaróz- vagy poliakrilamid-gélelektroforézissel lehet elválasztani. Részletesebb leírást és gyakorlati kimutatásra alkalmas módszereket Dodds (1986) tanulmánya tartalmaz.

Egyszerűsített módszer dsRNS kivonására (Morris et al., 1983)

  1. 10 g szövetet folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban elporítunk és 10 ml (vagy több) kétszeres töménységű, 1% SDS-t és 0,1% 2-merkaptoetanolt tartalmazó STE-pufferrel (1 × STE = 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8) extraháljuk.

  2. 10 ml vízzel telített fenol és 5 ml kloroform-pentanol (25:1) keverékével keverjük.

  3. A kivonatot 10 percig centrifugáljuk (10 000 g), majd a vizes felülúszót összegyűjtjük.

  4. A vizes fázishoz annyi etanolt adunk, hogy annak végső koncentrációja 16–18% legyen.

  5. Az oldatot lassan, kis mennyiségekben 18% etanolt tartalmazó, STE-pufferben szuszpendált cellulózporral (Whatman CF11) töltött oszlopra (injekciós fecskendő) öntjük.

  6. A cellulózoszlopot 18% etanolt tartalmazó STE-pufferrel néhányszor átmossuk, ami az egyszálú RNS-t és a DNS-t lemossa az oszlopról.

  7. A dsRNS-t kis mennyiségű (1–3 ml), alkoholt nem tartalmazó STE-pufferrel leoldjuk (eluáljuk) az oszlopról.

  8. 2,5 térfogat etanol hozzáadásával a dsRNS-eket kicsapjuk. Az alkoholos oldatot éjszakára –15 °C-ra vagy néhány órára –70 °C-ra helyezzük.

  9. A kicsapódott dsRNS-eket centrifugálással (10 perc, 10 000 g) gyűjtjük össze, majd a csapadékot kiszárítjuk. Feloldjuk 100 µl (10% RNáz-mentes szaharóz és egy kevés brómfenol-kéket tartalmazó) TPE-pufferrel (35 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, l mM EDTA, pH 7,6).

  10. Az oldatot 5 percig (5 000 g) centrifugálva tisztítjuk, majd a felülúszó nukleinsavmintát az előző példában leírtak szerint elektroforézissel elválasztjuk. Jelzőanyagként uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) vagy dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) dsRNS-t használhatunk.

Fás szárú növények esetében alkalmazható módszer (Watkins et al., 1990)

  1. 10 g friss vagy fagyasztott szövetet folyékony nitrogénnel mozsárban elporítunk és 20 ml 2% polivinil-pirrolidont (PVP) (Mt. 44000), 1% SDS-t, 1% bentonitot, 0,2% DIECA-t és 0,1% thioglicerolt tartalmazó TMS-pufferrel (100 mM TRIS, 10 mM magnézium-acetát, 500 mM NaCl, pH 8,5) extrahálunk.

  2. 20 ml (10% m-krezolt, 0,3 % 8-hidroxikinolint és 20 ml kloroform és pentanol 25:1 arányú keverékét tartalmazó) vízzel telített fenollal keverjük.

  3. Az elegyet 60 °C-on 15 percig állni hagyjuk.

  4. Az oldatot centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), a vizes felülúszót összegyűjtjük.

  5. A vizes fázishoz ml-enként 0,02 g cellulózport (Cellex N-1 vagy Whatman CF-11) és 0,22 ml etanolt (95%) adunk.

  6. A szuszpenziót 30 percig keverjük szobahőmérsékleten.

  7. Tízperces centrifugálást követően (10 000 g) a felülúszót elöntjük.

  8. A cellulózüledéket feloldjuk 1–2 ml 18% etanolt tartalmazó STE-pufferben (200 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7).

  9. 10 perces (10 000 g) centrifugálást követőn a felülúszót elöntjük.

  10. A cellulózüledéket kétszer mossuk 18%-os alkoholt tartalmazó STE-pufferben, a cellulózt centrifugálással gyűjtsük össze.

  11. Az utolsó mosáskor a cellulózt 18%-os etanollal szuszpendáljuk, és üvegoszlopra vagy eldobható injekciós fecskendőre öntjük, majd száradni hagyjuk.

  12. Az oszlopról a dsRNS-t és a maradék szennyező DNS-t etanolt már nem tartalmazó STE-pufferrel eluáljuk (leoldjuk).

  13. A leoldott dsRNS-t 2,5 térfogat etanollal (95%) kicsapjuk, és egy éjszakán keresztül állni hagyjuk –15 °C-on, vagy néhány órán keresztül –70 °C-on.

  14. A kicsapott nukleinsavakat centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), elöntjük a felülúszót, a csapadékot 1 ml (30 mM MgCl2-t tartalmazó) STE-ben oldjuk.

  15. 10 µg/ml DNázzal kezeljük és 60 percig inkubáljuk 30 °C-on.

  16. Hozzáadunk 1 ml (1 mM EDTA-t és 4% SDS-t tartalmazó) 20 mM-os Tris-puffert, majd 60 °C-on további 15 percig inkubáljuk.

  17. Azonos mennyiségű vízzel telített fenollal emulgeáljuk.

  18. Centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), majd összegyűjtjük a vizes felülúszót és hozzáadunk 2,5 térfogatnyi etanolt. Ezt követően egy éjszakán –15 °C-on vagy –70 °C-on néhány órát állni hagyjuk, míg a dsRNS-ek kicsapódnak.

  19. Centrifugálás után (10 perc, 10 000 g) a felülúszót elöntjük, a kicsapódott dsRNS-t kiszárítjuk. A csapadékot 100 µl RNáz-mentes, 10%-os szaharózoldatban készített, kevés brómfenol-kéket is tartalmazó TPE-pufferrel (35 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7,6) szuszpendáljuk.

  20. A szuszpenziót 5 percig centrifugáljuk (5 000 g), majd 20–40 µl mintát 7% TPE-pufferben készített poliakrilamid- vagy 1% agarózgélre felviszünk.

  21. A mintákat 50 V feszültség mellett 16–20 órán keresztül poliakrilamid-gélben, vagy 3–5 órán át agarózgélben futtatjuk.

  22. A géleket etidium-bromiddal vagy ezüstnitráttal festjük.