Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

13. fejezet - A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja

13. fejezet - A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja

Tartalom

A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei
Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata
Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből
A protoplasztok virológiai alkalmazása
A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek
A vírusgenom szerveződésének alaptípusai
A nukleinsavak jellemző végei
Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékek
A vírusnukleinsav-replikáció általános menete
A génkifejeződés általános módjai
A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben
A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek
A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és poliproteinek
A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és szubgenomi RNS
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és szubgenomi RNS-ek
A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció
Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia
A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív és ambiszensz nukleinsavak transzlációja
A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja
Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei
A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődése
Vírus-„szupercsaládok”
Feltételezések a vírusok törzsfejlődéséről

A vírusok – bár az élettelen és az élő anyag szerveződésének határterületén állnak – felfoghatók olyan obligát parazita (biotróf), azaz feltétlen élősködő szervezetekként is, amelyek önálló anyagcserével nem rendelkeznek, hanem a gazdanövény nukleinsav- és fehérjeszintetizáló rendszerét parazitálva annak anyagcseretermékeit (energiaforrásait, nukleinsavbázisait és aminosavait) használják fel saját bioszintézisükhöz. A vírusoknak önálló szaporodásuk nincs; ehhez az életjelenséghez ugyanis olyan szaporítószervekre vagy szaporító képletekre és önálló anyagcserére lenne szükségük, amivel nem rendelkeznek.

A vírusokat (és a viroidokat is) fertőző genetikai információként is felfoghatjuk, ami ebben a megfogalmazásban azt jelenti, hogy olyan fertőző (és betegségeket okozó) nukleinsavak, amelyek a gazdanövény nukleinsav-anyagcseréjébe kapcsolódva saját genetikai anyaguk újratermelését (bioszintézisét) biztosítják.

A vírusnukleinsavnak kettős szerepe van. Egyrészt meg kell sokszoroznia saját genetikai anyagát (ez maga a nukleinsav-replikáció); másrészt irányítania és kódolnia kell a gének kifejeződését, azaz a vírusfehérjék szintézisét (génexpresszió). A vírusfertőzött sejtben ez a két folyamat időben és térben szigorúan meghatározott sorrendben és elválasztva, rendezetten megy végbe, amelynek végső eredménye az új virionok szintézise.

A nyugalomban levő, meghatározott alakkal rendelkező (tehát elektronmikroszkóppal látható), inaktív vírusrészecskéket virionoknak nevezzük. A fertőzés után azonban a virionok „felbomlanak” (dissembly), és megkezdődik az új virionok szintézise. Ebben az állapotában „vegetatív vírus”-ként tartjuk számon a kórokozót. A szintetizált vírusnukleinsavak és a köpenyfehérje in vitro összeépülése (assembly) zárja a vírusbioszintézis folyamatát, amelynek végén újra virionok mutathatók ki, legtöbbször a vakuolumokban vagy a citoplazmában felhalmozottan. A vírusfertőzés következtében új genetikai információ kerül a sejtekbe, amelyek már a továbbiakban új, nehezen megbontható biológiai egységet jelentenek.

A replikáció vizsgálata során három alapvető kérdésre keressük a választ: 1. Hogyan szerveződik a vírusgenom (milyen géneket, milyen sorrendben tartalmaznak)? 2. E gének milyen módon nyilvánulnak meg (mi a génkifejeződés stratégiája)? 3. A szintézis milyen fehérjetermékeket eredményez (mi ezek feladata, működése)?

A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei

A vírusreplikációval kapcsolatos ismereteink az elmúlt két évtizedben ugrásszerűen szaporodtak. Ezt az időszakot – amelyet a molekuláris virológia és a biotechnológia kez-deti korszakának is tekinthetünk – több új, alapvető vizsgálati módszer bevezetése jellemezte.

Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata

A restrikciós endonukleázok (mikrogombákból vagy baktériumokból izolált, a kettős szálú nukleinsavszálakat nem a végeiken, hanem a lánc belsejében fajlagosan bontó enzimek) és a nukleinsavsorrendet meghatározó módszerek segítségével elsőként a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) mintegy nyolcezer bázispárból álló teljes nukleinsavsorrendje vált ismertté (Franck et al., 1980; Rezelman et al., 1980; Ahlquist et al., 1981; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982).

Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből

A fordított átírást (RNS-től függő DNS-polimeráz) szabályozó reverz transzkriptáz enzim retrovirusokból történt izolálása és azok növényvirológiai alkalmazása lehetővé tette az egyszálú RNS-vírusok kettős szálú DNS-kópiává (cDNS) történő átírását. E cDNS-szakaszok restrikciós enzimekkel bonthatók, szekvenciájuk meghatározható. Először a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) és viszonylagos egyszerűségük miatt az osztott genomú vírusok [tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus)] teljes szekvenciáit határozták meg (Goelet et al., 1982; Lomonossoff és Shanks, 1983). Napjainkra a legfontosabb típusvírusok e szempontból már ismertté váltak, és több esetben megismerhettük az egyes vírustörzsek közötti biológiai eltérések molekuláris hátterét is.

A protoplasztok virológiai alkalmazása

A genomban foglalt információk kifejeződéséről szerzett ismereteinket részben az izolált protoplasztok virológiai alkalmazásának köszönhetjük. A vírusfertőzés során a nukleinsav-replikáció és a vírusfertőzés többi lépése (sejtről sejtre terjedés, majd az egész növény fertőződése) során szükséges funkcionáló gének és fehérjék szerepe nem különíthető el pontosan. A sejtfaluktól enzimes (macerozim, celluláz, pektináz) úton megfosztott protoplasztok cm3-enként több millió sejtből álló szuszpenziója (66. ábra) azonnal fertőzhető, azaz a replikáció szempontjából szinkron-, in vivo rendszernek tekinthető. A génekben kódolt fehérjék szintézise viszonylag azonos időben történik meg, jól nyomon követhető. Az 1970-es évek végén és az 1980-as évek elején végzett kísérletek úttörő munkák voltak a molekuláris virológia kialakulásában (Takebe, 1975; Howell és Hull, 1978; Gonda és Symons, 1979; Jarvis és Murakishi, 1980; Nassuth et al. 1983).

66. ábra - Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok

Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok


A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek

E transzlációs rendszerek (retikulocita-lizátum, búzacsíra-kivonat, Xenopus oocyta) virológiai alkalmazhatósága azon alapszik, hogy ezekben az alakos sejtalkotórészeket nem, de riboszómákat tartalmazó szuszpenziókban – ha minden más feltétel (nukleozidok, energiaforrás, transzfer RNS-ek, stb.) adott – a kívülről bejuttatott pozitív értelmű ribonukleinsavak, így a vírusnukleinsavak is (mint messenger RNS-ek) az információjuknak megfelelő fehérjék szintézisét megindítják. Ez az folyamat is gyakorlatilag azonos időben megy végbe. A szinkron tenyészetek adták az első alkalmat a vírusok proteinszintézisének megismerésére (Efron és Marcus, 1973; Davies és Kaesberg, 1974; Dougherty és Hiebert, 1980). A két utóbbi módszer (protoplaszt- és sejtmentes fehérjeszintézis) eredményei együttesen adnak útmutatást a fehérjetermékekre, azok képzési mechanizmusaira.