Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben

A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben

A növénypatogén vírusok a génexpresszióhoz az alapvető lehetőségeket vírusnemzetségenként jellemző módon, egy formában, vagy különböző kombinációkban valósítják meg (Foster és Taylor, 1998). Ez a forma egyes nagyobb csoportok esetében hasonlóságokat mutat, ami alkalmas új vírusrendszer alapjainak felvázolásához is. Az alábbiakban csak néhány jól ismert stratégiát mutatunk be.

A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek

A potyvirusok [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic potyvirus), szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) stb.] virionjai helikálisak, kb. 700 nm hosszúak. Az egyszálú (+) RNS genom mintegy 10 000 nukleotidot tartalmaz. 5’ végén VPg van, 3’ vége poliadenilált. Az első, mintegy 85–205 nukleotid nem kódoló régiót egy hosszú leolvasási szakasz követi, amiről egyetlen (350–360 kD) hosszú poliprotein-prekurzor íródik át, amit a vírus által kódolt proteázok vágnak el a transzláció után funkcióképes fehérjékké. A potyvirusok génkifejeződésének szabályozását valószínűleg e különböző fehérjék időben eltérő megjelenése teszi lehetővé (Riechmann et al., 1992).

A potyvirusok génkifejeződését a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) példáján mutatjuk be (Riechmann et al., 1992) (68. ábra). Az első géntermék (P1 fehérje) biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott, de ismert, hogy proteolitikus aktivitású és transzport-fehérje funkciót is betölthet. A fertőzött levelek epidermiszsejtjeiben zárványok formájában halmozódik fel. A második végtermék a levéltetűvel történő átvitelt segítő fehérje (helper komponens, HC-Pro) szintén többfunkciós jellegű, nemcsak a vektorátvitelben van szerepe, de a floemben történő transzportban is. A fehérje C terminális része proteáz jellegű. A sejtekben amorf zárványokat alkot. A harmadik polipeptid (P3 protein) szerepe jórészt ismeretlen. Részt vehet a proteolitikus hasítás szabályozásában. A 6K1 és 6K2 fehérjéknek – szekvenciájuk alapján – a replikációban, a VPg mebránhoz kötésében van jelentőségük. A henger vagy forgó kerék (szélkerék) alakú citoplazmikus zárványfehérje (CI) a potyvirusok legjellemzőbb terméke. Helikáz-aktivitású. A kis sejtmagi zárványfehérje (NIa) proteáz-aktivitású, és felelős a poliprotein nagyobbik részének hasításában. A genomhoz kötött protein (VPg) az RNS pozitív szálak szintézisének megindításához szükségesek. A nagy sejtmagi zárványfehérje (NIb) anyagáról feltehető, hogy ez az RNS-től függő RNS-polimeráz, ami a CI, a VPg(NIa), valamint a 6K1 és 6K2 fehérjékkel együtt a replikációs komplex egyik tagja. A hosszú polipeptidlánc utolsó származéka a kapszid- vagy köpenyfehérje (CP). Szerepe – a nukleinsavat védő funkcióján kívül – a gazdaspecifitásban és a levéltetűvel történő átvitelben van. A potyvirusok taxonómiája elsősorban a köpenyfehérje eltérésein alapul. A CP N terminális része igen változékony, vírus- és törzsspecifikus eltéréseket tartalmaz. A középső régió erősen konzervatív, ez felelős a sejtről sejtre terjedésért és a vírus összeépüléséért. A C és az N végek a virionok felületén helyezkednek el.

68. ábra - A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro) = P1 fehérje proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje, 6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) = citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 = 6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) = sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP = köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a szövegben [Riechmann et al., 1991 után]

A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro) = P1 fehérje proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje, 6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) = citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 = 6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) = sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP = köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a szövegben [Riechmann et al., 1991 után]


A potyvirusok jellegzetes replikációjában az egyes fehérjetermékek azonos, tehát ekvimoláris mennyiségben termelődnek. Ahhoz, hogy egyetlen köpenyfehérje-molekula kialakuljon, az egész nukleinsavnak újra transzlálódnia kell. Ennek a „gazdaságtalan” termelésnek egyrészt az a következménye, hogy kevés a növényben felhalmozott burok- (kapszid-) fehérje és virion mennyisége, másrészt a bioszintézis más „felesleges” termékei zárványok formájában halmozódnak fel.

A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és poliproteinek

A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) a Comovirus nemzetség típus tagja. A vírusnemzetség hazai képviselője a vöröshere tarkulás vírus (red clover mottle comovirus). A genom két (+) RNS szálra osztott (M és B); ezek külön-külön, azonos méretű (30 nm) izometrikus virionokban enkapszidálódnak. A rövidebb M szál 3481 nukleotidból (nt) áll. A hosszabb B szál 5889 nt nagyságú. Mindkét szál 5’ végén kovalens kötésű VPg található, a 3’ végén poliadenilált. Mindkét szál első 44 kezdeti szekvenciáiban, illetve a szálak adenilált része előtti szakaszaiban nagy a hasonlóság. Ez utóbbinak valószínűleg a köpenyfehérje-felismerésében van szerepe (69. ábra).

69. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a transzláció utáni hasadás termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991 után]

A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a transzláció utáni hasadás termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991 után]


Az egyes szálak külön replikálódnak. Mindkét szál replikatív formáját a fertőzött levelekben azonosították, és csak egy-egy leolvasási szakaszt tartalmaznak. A replikáció során így mindkét szálról csak egy poliprotein (105 és 202 kD) szintézise valósul meg, amelyek a transzláció után proteolitikusan alegységekre hasadnak. A protoplasztok fertőzésekor kimutatható első hosszú polipeptid (202 kD) többlépcsős hasadási termékei közül egy (32 kD) proteáz-aktivitású, míg az 58 kD-os fehérje a replikáz enzim része, de ugyanennek a poliproteinnek a terméke a 4 kD nagyságú VPg is. A 110 kD nagyságú replikáz enzim is a B komponensben kódolt. Ha a protoplasztokat csak a B komponenssel fertőzték, akkor virionok nem képződtek. Eredménytelen volt a protoplasztok fertőzése akkor, ha azokat csak a rövidebb komponenssel fertőzték. Az eredménytelenség oka – ma már nyilvánvalóan – arra vezethető vissza, hogy a replikáz enzim kódja a B RNS-hez kötött. Ha a két komponens a fertőzéskor együtt volt, akkor a fertőzés eredményes volt, és komplett virionok is képződtek. A virionokhoz szükséges két köpenyfehérje (37 és 23 kD) ugyanis az M szálon kódolt, hasonlóan az 58 és 48 kD nagyságú fehérjékkel, amelyek a sejtről sejtre terjedés feltételeit biztosítják. A 48 kD nagyságú fehérjét a membránokból izolálták. Mindezek a peptidek egyetlen polipeptid (105, illetve 95 kD) hasadási termékei, ezt az elsődleges terméket azonban – valószínűleg gyors bomlása miatt – a fertőzött protoplasztokból nem lehetett kimutatni. Mindkét elsődleges poliproteinszál hasítását a B komponensben kódolt (24 kD) fehérje végzi (Goldbach és van Kammen, 1985; Rezelman et al., 1989).

A vírusszintézisben a B komponensben kódolt 60 és 58 kD, illetve 110 kD fehérjék mellett részt vesznek a gazdanövény polimeráz emzimei is, amelyek jelenlétét sikerült a fertőzött növényekből kimutatni (Dorssers et al., 1984). A replikáció helye a citoplazma, a virionok a sejtfal mellett tubuláris szerkezetű formákból, a viroplazmából mutathatók ki, majd a citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel.

A comovirusokhoz hasonló replikációs stratégiát követnek a nepovirusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) és a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)] is.

A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és szubgenomi RNS

A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) a gabonaféléket hazánkban is gyakran fertőző, jól ismert kórokozó. Három részre osztott genomja 8243 nukleotidot tartalmaz (Ahlquist et al., 1984; Ahlquist, 1987). Az egyes nukleinsavszálak mellett az izometrikus (30 nm) virionokba még egy kis szubgenomi RNS is enkapszidálódik úgy, hogy cukorgradiens-centrifugálással csak három nukleinsavat tartalmazó [nehéz (B), közepes (M) és könnyű (L) frakció különíthető el] (70. ábra). A nehéz, B szálban egy hosszú nukleinsavszál (RNS1) van, a középsőben két kisebb (RNS3 és a szubgenomi RNS), míg a harmadik frakcióban ugyancsak egy szál (RNS2) foglal helyet. A fertőzött növényből azonban egy negyedik, nukleinsavat nem tartalmazó üres köpenyfehérje-kagylókból álló (T), ún. felső frakció is elválasztható.

70. ábra - A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer RNS-szerű vég, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton [Matthews, 1991 után]

A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer RNS-szerű vég, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton [Matthews, 1991 után]


Az RNS1 3234, az RNS2 2865 és a RNS3 2144 nukleotidot tartalmaznak. Minden szál 5’ végén metil-guanozin „sapkát”, 3’ végén tirozin megkötésére alkalmas traszfer-RNS-hez hasonló másodlagos szerkezetet hordoz. Elvileg minden nukleinsavszálon egy gén foglal helyet, azaz egy leolvasási szakaszt tartalmaz. Ez alól kivétel az RNS3, amelyen két, fehérjének megfelelő leolvasási szakasz is helyet foglal. A két gén között rövid, mintegy 250 nukleotid hosszúságú nem kódoló szakasz is van, amiből mintegy 20 adenilált.

A replikációs stratégia lényege a genom osztottságából ered. Az RNS-eken csak egy leolvasási szakasz van, ami egy-egy fehérje szintézisét teszi lehetővé. A harmadik RNS-szál azonban két cisztront is tartalmaz, a 3’ vég felé eső részen foglal helyet a köpenyfehérje-gén. Ez egy új, genomnál kisebb, 0,9 kilobázis nagyságú szubgenomi RNS szintézisén keresztül olvasódik le. A szubgenomi RNS maga is hasonló a genomi RNS-ekhez, amennyiben ez is 5’ végén „sapkát” hordoz, 3’ vége pedig szintén tRNS-jellegű. A szubgenomi RNS maga is enkapszidálódik az RNS3-al, együtt alkotva a középső (M) frakciót.

Az RNS1 terméke (109 kD) részt vesz az RNS-replikációban, metil-transzferáz- és helikáz-aktivitása van. Az RNS2 által kódolt fehérje (94 kD) szintén részt vesz a replikációban (valószínűleg ez az RNS-függő RNS-polimeráz enzim). Az RNS3 olyan fehérje (32 kD) szintézisét irányítja, ami a vírus növényen belüli elterjedését segíti (transzport-fehérje). A negyedik termék – amelynek szintézise a rövid szubgenomi RNS-től függ – a köpenyfehérje (20 kD).

A replikáció – feltehetően a genom osztottsága miatt – igen gyors és nagyon hatékony. Mind a négy kettős szálú RNS (dsRNS) kimutatható a fertőzött protoplasztokból. Először a hosszabb RNS-ek termékei jelennek meg, majd az idő haladtával túlnyomóvá válik a köpenyfehérje szintézise. A különböző bromovirusok egyes komponensei (például az RNS3) annyira hasonlóak, hogy azok egymással kicserélhetők [tehénborsó klorotikus tarkulás vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus)] (pszeudo-rekombináció). A vírustörzsek, esetleg vírusfajok közötti rekombináció a faj számára nagy evolúciós előnyt jelenthet, az új kombinációk a természetes szelekció révén vagy állandósulhatnak, vagy eltűnhetnek.

A bromovirusok a sejtmagban [pl. lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle bromovirus)] replikálódnak, de az új virionok a citoplazmában (esetenként viroplazmában) halmozódnak fel. A bromovirusokhoz hasonló replikációs utat követnek a cucumovirusok [pl. uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], a hordeivirusok [pl. árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus)] és az ilarvirusok [pl. alma mozaik vírus (apple mosaic ilarvirus)], valamint a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Utóbbi kórokozó e szempontból azért érdekes, mert a nukleinsav-replikáció kezdeményezésében a köpenyfehérjének különleges szerepe van.

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és szubgenomi RNS-ek

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a tobamovirus nemzetség típustagja. A legrégebben és legrészletesebben tanulmányozott víruskórokozó. A genom egy pozitív szálú, 6395 nukleotidból álló RNS. Teljes szekvenciája 1982 óta ismert (Goelet et al., 1982). Az 5’ végen 7-metil guanozin sapka (m7Gppp), a 3’ vég tRNS-szerű (hisztidint kötő) másodlagos szerkezetű. Az RNS 3’ végétől kb. 1000 nukleotid távolságra a köpenyfehérjét specifikusan felismerő és megkötő szekvenciák helyezkednek el. Az RNS első 70 nukleotidja és a 3’ vég utolsó szekvenciái fehérjét nem kódoló szakaszok.

Az első leolvasási szakasz egy 126 kD nagyságú fehérje szintézisét teszi lehetővé. Ezt egy gyenge stop kodon (UAG) követi, ami lehetővé teszi annak „átolvasását” és ezen keresztül a második leolvasási szakasznak megfelelő, az előbbinél hosszabb fehérjeszakasz (183 kD) szintézisét eredményezi (71. ábra). E fehérje 5’ vég felőli része szekvenciájában teljesen azonos a 126 kD fehérjével. Az átírt szakasz, ami a harmadik leolvasási szakasznak felelne (ORF3) meg, elvileg egy önálló (54 kD) fehérje lehetne, ezt a fehérjét azonban a fertőzött növényekben nem találták meg. Mind a 126, mind a 183 kD fehérje RNS-től függő RNS-polimeráz, tehát maga a replikáz enzim.

A belső gének további kifejeződése szubgenomi RNS-ekhez kötött. Az I2 szubgenomi RNS két leolvasási szakaszt (ORF4 és ORF5) is tartalmaz, amelyek közül csak az első (ORF4) nyilvánulhat meg. Ennek terméke a 30 kD nagyságú peptid, transzport-fehérje, tehát a sejtről sejtre történő terjedésben van szerepe. A belső leolvasási szakasz (ORF5) transzlációja csak egy újabb, egycisztronos, kis szubgenomi RNS (sRNS) révén valósul meg. Az ORF5 a köpenyfehérje (17,6 kD) kódját foglalja magában. Mindkét szubgenomi RNS-t (I2 és sRNS) a fertőzött növényekből izolálták. Érdekes, hogy a két szubgenomi RNS közül csak az sRNS metilált. A rövid sRNS gyors és nagy tömegű köpenyfehérje szintézisét teszi lehetővé. A köpenyfehérje szerepe többoldalú, egyrészt védi a nukleinsavat a káros külső hatásoktól, másrészt részt vesz a kompatibilitási viszonyok kialakításában is.

A vírusreplikáció általános menete a A vírusnukleinsav replikációjának általános menete című fejezetrészben ismertettek szerint történik. A sejtbe került virionokról – valószínűleg több pontból kiindulva – a köpenyfehérje elemésztődik, szabaddá válik az RNS 5’ vége, ahonnan a 80S riboszómákon megindul az első két ORF-termék szintézise. Mindkét fehérje részt vesz annak a replikációs komplexnek a kialakításában, amiben a gazdanövény által kódolt fehérjéknek is meghatározó szerepük van. A vírusspecifikus RNS-től függő RNS-polimeráz a membránhoz kötött poliriboszómákhoz (30 000 g frakció) kötődik. Ez katalizálja mind a pozitív, mind a negatív szál szintézisét. E frakcióból mind a replikatív forma (RF), mind a replikatív intermedier (RI) jelenléte kimutatható.

A szubgenomi RNS-ek szintézisének szabályozási mechanizmusa kevésbé ismert. A replikáció végén felszaporodó köpenyfehérje felismeri az RNS 3’ véghez közeli (5290–5527 nukleotid közötti), speciális bázispárosodású szakaszait (felismerési régió), és megkezdődik mindkét irányban a köpenyfehérje-korongok nukleinsavval történő összeépülése (assembly) és az új virionok kialakítása. A reakció in vitro körülmények között is végbemegy, egyes esetekben a kötőhelyek a rokon vírusok fehérjéit is felismerik.

A vírusszintézis helye a citoplazma, az endoplazmatikus retikulum speciális része (viroplazma). Felmerült annak a lehetősége is, hogy a kloroplasztiszok is a vírusbioszintézis helyei. Valószínűbb azonban, hogy a vírus-köpenyfehérje és a virionok csak később épülnek be a színtestekbe. A képződött új virionok a citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel igen nagy mennyiségben, s gyakran hexagonális parakristályos formába rendeződnek.

A tobamovirusokhoz hasonló expressziót követnek az egyéb tulajdonságaikban távol álló luteovirusok is.

A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció

A caulimovirusok a kettős szálú DNS-vírusok egyedüli képviselői. Típustagjuk a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus). Gazdasági kárt nem okoz, tudománytörténeti szempontból mégis jelentős. Kezdetben a magasabbrendű szervezetekre jellemző génállománya miatt került a molekuláris biológiai, majd a biotechnológiai, génsebészeti kutatások homlokterébe. Később a replikációs stratégia különlegessége keltette fel iránta azt a tudományos érdeklődést, amely mind a mai napig tart. Nukleinsav-újratermelése ugyanis egy RNS-től függő DNS-polimeráz, a reverz transzkriptáz enzim működésén alapul. E replikációs mód az állat- és humánpatogén retrovirusokra jellemző, ezért is használják a caulimovirusokra a pararetrovirus elnevezést.

A karfiol mozaik vírus több törzsének a teljes nukleinsavsorrendje már viszonylag korán ismertté vált (Franck et al., 1980; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982). A genom két, bázispárosodással pontosan illeszkedő, kör alakú DNS-szálból áll (72. ábra). A bázispárok száma kb. 8000. A külső (alfa) szál egy helyen szakad meg (gap 1 = kapu), míg a belső (béta) szálon két kapu is van (gap 2 és 3). A genom hat gént, de nyolc elvi lehetőséget tartalmaz.

Az első nyitott leolvasási szakasz (ORF I) terméke a 37 kD nagyságú fehérje, amit a fertőzött levelek sejtfalfrakcióiból lehet kimutatni. Szerepe a plazmodezmák átjárhatóságának biztosítása, tehát transzlokációs fehérjének tekinthető. A második és harmadik gén (ORF II és ORF III) termékei hasonló (18, ill. 15 kD) nagyságúak. Az első (18 kD) a levéltetűvel történő vírusátvitelt segíti (helper protein), az utóbbi (15 kD) strukturális fehérje a virion belsejében van. A negyedik fehérje (57 kD) az ORF IV terméke, a köpenyfehérje előanyaga, belőle származik proteolízissel a köpenyfehérje (42 kD). Az ORF V a leghosszabb leolvasási szakasz, egy RNS-től függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzimet kódol. A hatodik, az ORF VI génterméke a viroplazma-fehérje, szerepe a betegség indukciójában és a tünetek kifejlődésében van. Az utolsó két kis molekulatömegű fehérje (ORF VII és OFRF VIII) szerepe nem kellően ismert.

A caulimovirusok nukleinsav-szintézise különleges módon történik (73. ábra). A sejtbe jutott virionok köpenyfehérje-burkukat elveszítve jutnak el a sejtmagba. Itt a két DNS-szálról a kapukat átfedő RNS-végek leoldódnak és a genom teljes (megszakítás nélküli) kettős kört formál, ún. minikromoszómát alkot. A továbbiakban a szálak közötti kötés fellazul. Az egyik (alfa) szálról mRNS-ek szintézise (19 S és 35 S RNS) indul meg. Közülük a 35S RNS a genom teljes információit hiánytalanul tartalmazza. A replikáció második szakaszában mindkét RNS-szál elhagyja a sejtmagvat és a citoplazmába jut. Itt a 19S RNS a viroplazma fehérjeszintézisét irányítja.

A 35S RNS a viroplazmában kezdi meg egy új DNS- (–) szál szintézisét, tehát egy fordított transzkripciót, azaz RNS-től függő DNS-szintézist (Guilley et al., 1983; Hull és Covey, 1983). A reakciót katalizáló enzimet reverz transzkriptáznak nevezzük. Ehhez hasonló különleges enzim csak az állatpatogén retrovirusokban fordul elő. Így, ha rövid időre is, de egy RNS-templát és a neki megfelelő DNS- (–) szál együtt fordul elő. A későbbiekben a mRNS-t RNázok elemésztik (egy rövid rész megmarad a gap-ek borítására), és a (–) DNS-szálról mint primerről másik (+) DNS-szál képződik (Hull et al., 1987).

Az új DNS-szálak szintézisével lépést tartva történik a köpenyfehérje-szintézis. Az új DNS-szálak a köpenyfehérjével komplett virionokat alkotnak, amelyek elsősorban a viroplazmában vagy azok közvetlen közelében halmozódnak fel.

Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia

A geminivirusok különlegessége, hogy a genom az amúgy is jellegzetes (18 × 30 nm nagyságú) ikerpartikulumokban egyszálú, kör alakú DNS. Ez lehet egyetlen szál [pl. búza törpülés vírus (wheat dwarf monogeminivirus)], vagy két szál [pl. bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)]. A bigeminivirusok két DNS-szála különböző. A harmadik csoport (hybrigeminivirus) nukleinsava mindkét alaptípusra hasonlít; a két szál hasonló, de nem azonos. Típus képviselőjük pl. a répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top hybrigeminivirus, újabban: beet curly top curtovirus). A geminivirusok replikációs stratégiája több hasonlóságot mutat. Minden geminivirusban megtalálható egy arginin–timin gazdag hurok, és egy rövid, kb. 200 nukleotid nagyságú, fehérjét nem kódoló, közös szakasz.

A replikáció módját legismertebb képviselőjük, a kukorica csíkosság vírus (maize streak monogeminivirus, újabban: maize streak mastrevirus) példáján (Stanley, 1985; Stanley és Davies, 1989) mutatjuk be. Az egyszálú, cirkuláris genom 2687 nukleotidból áll (Mullineaux et al., 1984). A nukleinsavszálon négy nyílt leolvasási szakasz van, kettő a pozitív polaritású, ún. „virionszálon” (V1 és V2), kettő pedig a negatív, ún. „komplementer szálon” (C1 és C2). E két szálrészt egy rövid intergenikus szakasz választja el egymástól. Az első (V1) fehérjetermék (10,9 kD) szerepe ismeretlen, a második (V2) a köpenyfehérje (27 kD). A másik leolvasási szakaszon is két fehérje kódolt (C1 és C2), ezek a replikációhoz szükségesek (74. ábra). A transzláció egyszerre, két irányban megy végbe. Maga a nukleinsav-replikáció kétszálú formák (dsDNS) képzésével, ún. „forgó kerék” (rolling circle) formában valósul meg, amely folyamatban a gazdanövény fehérjéi is szerepet kapnak. A fehérjeszintézis ún. naszcens RNS-primerek segítségével történik (Dhar és Singh, 1995).

74. ábra - A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a szövegben [Mullineaux et al., 1984 után]

A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a szövegben [Mullineaux et al., 1984 után]


A replikáció a sejtmagban történik, ugyanitt halmozódnak fel a kész virionok is, gyakran kristályos elrendeződésben. A citoplazmában granuláris zárványok figyelhetők meg. Számos geminivirus a floem parenchima szöveteiben található nagyobb mennyiségben (Harrison, 1985).

A kétszálú geminivirusok [pl. a bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic bigeminivirus, újabban: bean golden mosaic begomovirus)] szekvenciái – a közös régiótól eltekintve – eltérőek. Elnevezésük szerint a két szál: DNS-A és DNS-B. Ezek felépítése is elkülönül virion részre és komplementer szálra, tehát a transzkripció itt is egyszerre két irányban valósulhat meg. A DNS-A szálon átfedésben a replikációs fehérjék (AC1, AC2, AC3) olvasódnak le. Ezek közül az AC1 elég a replikációhoz, a többi termék csak a hatásfokot növeli. A DNS-A komplementer szál két fehérjét (AV1 és AV2) kódol. Az első szerepe nem ismert, a második a köpenyfehérje. A DNS-B szál virion része és komplementer régiója is egy-egy transzlokációs fehérjét (movement protein) kódol (BV1, BC1). A geminivirusok replikációja a sejtmagban megy végbe, itt jellegzetes fibrilláris citopatológiai elváltozásokat is okoznak. A virionok parakristályok formájában itt halmozódnak fel.

Újabban olyan egyszálú DNS-vírusokat fedeztek fel, amelyek a geminivirusokhoz hasonló felépítésűek, virionjaik izometrikusak, de nem ikervirionokból állnak. Növénypatogén képviselőik pl. a levéltetvekkel terjedő banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top nanavirus) vagy a kabócák útján fertőző kókusz hajtás leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus). E víruscsalád (Circoviridae) genomja a geminivirusnak mintegy fele (kb. 1 kilobázis). A genom szerveződése távoli hasonlóságot mutat a geminivirusokkal. A hurokképződés itt is megfigyelhető egy fehérjét nem kódoló szakaszon, és feltehetően hasonlóság van a génkifejeződésben is (Chu et al., 1995).

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív és ambiszensz nukleinsavak transzlációja

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kb. 80–100 nm, változó nagyságú, nem teljesen gömb alakú (teleomorf) virionjait – a többi növénypatogén vírusoktól eltérően – kettős glükoproteid burok veszi körül. A virionban három nukleinsavszál foglal helyet. A leghosszabb (L-RNS) szál (8,9 kb) negatív polaritású. A középső (M-RNS 4,8 kb) és a rövid (S-RNS 2,9 kb) szál kezdeti (5’ végi) szakasza pozitív, végső (3’ felőli) negatív, azaz kettős (ambiszensz) jellegű (75. ábra). A negatív RNS-szál információja csak úgy nyilvánulhat meg, ha róla egy pozitív, azaz messenger aktivitású komplementer szál képződik. E mRNS terméke egy nyitott leolvasási szakasznak megfelelő (331 kD nagyságú) protein. A másik két vírus RNS (M és S) ambiszensz jellege azzal az előnnyel jár, hogy a rajtuk levő gének egyszerre olvasódhatnak le. A pozitív részen ez közvetlenül megy végbe, míg a negatív részről ugyanúgy mRNS segítségével, mint az L (–) szál esetében is történik. A leghosszabb RNS-szál (L) fehérjeterméke 331 kD, ami a nukleinsav-szekvencia alapján feltehetően a polimeráz enzim. Az S-RNS két fehérjét (N 28,8 kD és NSs 54,2 kD) kódol, az M-RNS pedig az NSm-fehérje (33,6 kD) és a két glükoproteid (G1/G2 127,4 kD) szintézisét irányítja (de Haan, 1994).

75. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott genomja és génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje (protein), kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után]

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott genomja és génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje (protein), kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után]


A replikáció helye a viroplazmában van. A glükoproteid-membrán vagy az endoplazmatikus retikulumból, vagy a Golgi-készülékről szakad le és burkolja be a virionokat. Ennek megfelelően a glükoproteid-burok egy része gazdanövény eredetű, hasonlóan a gerinceseket fertőző bunyavirusokhoz, amelyeknél a glükoproteid-burkokat a gazdaszervezet szolgáltatja.

A tospovirusok különös érdekessége a defektív részecskék képződése. Sorozatos mechanikai átvitelek után glükoproteid-burok nem képződik, ami azzal jár, hogy a burok nélküli vírusrészecskék elvesztik tripsz vektorokkal (Thrips spp., Frankliniella spp. Scirtothrips ssp.) történő átvihetőségüket.

A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja

Szatellit vírusok

Már az 1920-as években felfigyeltek arra, hogy egyes, a dohány nekrózis vírussal (tobacco necrosis necrovirus) fertőzött növényekben nemcsak a dohány nekrózis vírusra jellemző 30 nm átmérőjű izometrikus virionokat lehetett kimutatni, hanem azoknál lényegesen kisebb, 18 nm átmérőjű, ugyancsak izometrikus virionokat is. Ezek a szatellit vírus elnevezést kapták, hasonlóan a nagyobb égitestek mellett előforduló kis bolygókhoz (szatellitek). Ezek a csak részben vagy egyáltalán nem önálló virionok egymagukban nem fertőzik a növényeket, csak az őket segítő (helper) vírussal együtt. A satellivirusok jellegzetes képviselője, a szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) replikációjában az őt segítő helper vírustól specifikusan függ. E sajátos függés alapja, hogy a szatellit vírus genomja replikációra képtelen, e folyamathoz a segítő vírus replikáz enzimét használja fel, mintegy a helper vírust parazitálva. A szatellit dohány mozaik vírus mintegy 1200 bázis nagyságú genomja csak egy gént kódol, a saját köpenyfehérje-szintéziséhez szükséges információt tartalmazza. A helper és szatellit virionok köpenyfehérjéje teljesen eltér egymástól. A hosszú, fehérjét nem kódoló szakasz szerepe szinte ismeretlen, feltételezhetően a virion stabilitásában van szerepe.

A szatellit vírusok jelenléte egyes esetekben lényegesen befolyásolja a tünetek megjelenését, azok erősségét. Ennek oka az, hogy a szatellit jelenlétében – feltehetően versengés következtében – visszaszorul a helper vírus replikációja. Hasonló működésű szatellit vírusokat [pl. szatellit köles mozaik vírus (panicum mosaic satellivirus)] is leírtak, de ezek nincsenek egymással rokonságban.

Szatellit RNS-ek

Az 1970-es években Elszász tartományban figyeltek fel a paradicsom járványos pusztulására. A fertőzött növényekből az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) izolálták. A tisztított vírus nukleinsav-vizsgálata azonban azt mutatta, hogy az uborka mozaik vírus három genomi és egy szubgenomi RNS-e mellett még egy ötödik, rövid nukleinsav is előfordult a virionokban enkapszidált formában (Kaper és Waterworth, 1977, 1981). Ez az ötödik, az uborka mozaik vírushoz kapcsolt nukleinsavszál (cucumber mosaic virus associated RNA5, CARNA5) okozta a tünetek súlyosságát, a beteg növények teljes pusztulását. A CARNA5 jelenléte a virionokban nem befolyásolta a levéltetű-átvitelt.

A CARNA5 genom 330–390 bázis nagyságú. A helper vírusához hasonlóan a szatellit RNS 5’ vége metilált (m7Gppp), 3’ végén hidroxilcsoport van. A genomon egytől három nyílt leolvasási szakasz is van, ezek azonban in vivo fehérjét nem kódolnak. A szatellit vírusokhoz hasonlóan a szatellit RNS-ek jelenléte az inokulumban jelentősen csökkenti a fertőzőképességet. A helper vírus RNS1 és RNS2 egyes szakaszai komplementerek a szatellit RNS-sel, illetve maguk is képesek megkötni a helper vírus köpenyfehérjéjét. Ez a térszerkezet teszi lehetővé a szatellit RNS-ek beépülését a helper vírus virionjaiba.

A helper vírusokhoz hasonló felépítésű szatellit RNS-ek replikációja a helper vírustól függ. Abban az esetben, ha a szatellit RNS nem hasonlít a helper vírusra, akkor egy negatív templáton alapuló, autokatalitikusan bomló kétszálú RNS-ről képződnek az új RNS-szálak (forgó kerék mechanizmus). Ez a viroidokra jellemző replikációs formához hasonló.

Számos vírusnál [pl. földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus)] is megfigyelték a szatellit RNS-ek jelenlétét, a nepovirusok körében pedig általánosan előfordulnak (Murant és Mayo, 1982; Francki, 1985). Azt is megfigyelték, hogy a szatellit vírusok jelenléte – a helper vírus replikációjának visszaszorítása révén – csökkentheti is a tüneteket. Harrison et al. (1987) kimutatták, hogy az uborka mozaik vírus szatellit RNS-sel transzformált dohánynövényekben az uborka mozaik vírus tünetei mérséklődtek és replikációja is gátlást szenvedett, a rendszer biológiai védekezésre alkal-mas volt.

A szatellit vírusok annyiban hasonlók a szatellit RNS-ekhez, hogy a) mindkettő genomja rövid, egyszálú RNS; b) a replikációjuk a helper vírustól függ; c) a replikációjuk visszaszorítja a helper vírus replikációját; d) saját RNS-templátjukat használják fel; e) jelenlétük a tüneteket befolyásolja (gyengíti vagy erősíti). Különbség, hogy a szatellit vírusok önálló virionokat alkotnak, míg a szatellit RNS-ek a helper vírussal közösen enkapszidálódnak.

Szatellit DNS-ek

Újabban a paradicsom levélgöndörödés vírussal (tomato leaf curl bigeminivirus = begomovirus) kapcsolatban szatellit DNS-t mutattak ki (Dry et al., 1998). Ez az első adat arra vonatkozóan, hogy nemcsak szatellit RNS-molekulák, hanem szatellit DNS-molekulák is vannak.

Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei

A paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus) esetén kimutatták, hogy a fertőzött növényekben a vírusreplikáció során néha olyan „hibás” virionok is keletkeztek, amelyek nem a teljes genomot, hanem annak töredékeit tartalmazzák (Hillmann et al., 1987). Ennek megfelelően ezek a nukleinsavak homológ szekvenciákat mutatnak az eredeti vírus RNS-sel, deléciós mutánsként is felfoghatók. Általában defektív interferáló RNS-eknek (DI) nevezzük, mert felszaporodásuk a fertőzött növényekben jelentősen gátolja a teljes genomú vírus replikációját és a betegség tüneteit. A defektív RNS-ek replikációja és enkapszidációja teljesen a „helper” vírustól függ. Kialakulásával kapcsolatban kétféle feltevés is van: (1) a replikáció során meghatározott helyeken autokatalitikus vagy enzimatikus hasítással jöttek létre; vagy (2) az RNS-polimeráz a replikáció során ugyanannak az RNS-nek más pontjára „átugrott”. Ez utóbbi feltételezést több kísérleti érv is támogatja (Roux et al., 1991).

Defektív interferáló RNS-ek gyakran fordulnak elő a tombusvirus nemzetségben [pl. cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (cymbidium ringspot tombusvirus)] (Burgyán et al., 1989), de az állatpatogén vagy a gombákat fertőző vírusok között is.