Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

14. fejezet - Szerológiai vizsgálati módszerek

14. fejezet - Szerológiai vizsgálati módszerek

Immunológiai alapfogalmak

A növényvírusok többféle (1–10) proteint kódolnak, amelyekből a zárványfehérjék és a köpenyfehérjék fordulnak elő a legnagyobb koncentrációban a fertőzött növényben. E kettő közül a köpenyfehérjék azok, amelyeket antigénként a leggyakrabban felhasználnak a vírusfertőzés kimutatására (Matthews, 1957; Siitari et al., 1986; Brakke, 1990). A szerológiai reakciók alapelve az a felismerés, hogy ha melegvérű állat vérébe nagy molekulatömegű fajidegen anyag (pl. fehérje) kerül, akkor ez az állat vérsavójában ellenanyag (antitest, immunoglobulinok) képződését indukálja. Az antitestképzés fajlagos, azaz egy antigén hatására csak a neki megfelelő antitest képződik. Az antitestek a nekik megfelelő antigéneket felismerik, így létrejön az immunválasz-reakció, ami lehetővé teszi a kórokozó pontos azonosítását.

Az immunválasz

Az antigén hatására bekövetkező immunválasz molekuláris magyarázata Harlow és Lane (1988), Long és Kindt (1988), Ezquerra és Coligan (1988), továbbá Fox (1988) kutatók nevéhez fűződik.

Az antigén-specifikus antitestképződéshez az állatban háromféle, egymással kölcsönhatásban álló sejt (az ún. antigénhez kapcsolódó sejt, továbbá a T sejt és a B limfocita sejt) összehangolt működése szükséges. Ha az antigén bekerül az állat testébe, az antigénhez kapcsolódó ún. APC sejtek (APC: antigen-presenting cell) a makrofágokhoz hasonlóan bekebelezik és átformálják azt (78A ábra). Ezután a „megemésztett” antigén az APC sejt felszínére kerül, ahol egy speciális, kompatibilis, ún. MHC (MHC: major histocompatibility molecule) molekulához kapcsolódik. A következő lépésben a T sejt – amely mind az átformált antigén, mind pedig az MHC molekula kapcsolódásához alkalmas receptorhelyekkel rendelkezik – összekapcsolódik az APC sejttel (78B ábra). Ekkor az APC sejt felületén létrejön egy három molekulából álló komplex, a T sejt antigénreceptora, az átformált antigén és az MHC molekula között (78C ábra). Ez a komplex az APC és a T sejteket oldékony anyagok, ún. interleukinok (IL-1, IL-2) kiválasztására serkenti, amelyek a T sejteket aktiválják (78D és 78E ábra). Az aktivált T sejtek ezután az antigénhez kapcsolódó B sejtekhez kötődnek. Ekkor a T sejtek elkezdik az IL-4 és IL-5 anyagok termelését, amelyek a B (limfocita) sejtek osztódását és differenciálódását stimulálják (78F ábra). Megfelelő serkentés esetén a B sejt immunoglobulin-genomja közvetlenül antitest képződését indukálja. Ha az állat immunrendszere később ugyanazzal az antigénnel találkozik, az immunoglobulin genom azon része, amely az antigénmegkötő sajátságért felelős, szomatikus mutációk sorozatán megy át. Ezek a mutációk pedig antitestek képződését indukálják, melyek többé-kevésbé affinisak az adott antigénre.

78. ábra - Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti kölcsönhatás [Hampton et al., 1990 után]

Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti kölcsönhatás [Hampton et al., 1990 után]


Azok a B sejtek, amelyek az antigénnel szemben nagymértékű affinitással rendelkező antitestet képeznek, több és több antigént vonzanak, gyorsan növekednek, osztódnak és még több magas affinitású antitestet képeznek. A T sejtek által kiválasztott IL-5 anyag – más szignálokkal együtt – arra serkenti a B sejteket, hogy vagy rövid (3–4 napos) élettartamú, nagy mennyiségű antitestet kiválasztó plazmasejtekké, vagy pedig hosszú élettartamú, ún. memory (emlékező) sejtekké differenciálódjanak. Az ún. memory B sejtek elsőrendű feladata, hogy reagáljanak egy újabb antigénstimulusra, és nem az antitestek kiválasztása, hanem inkább azok megjelenítése történik meg a felületükön (78F ábra).

Egy anyag akkor antigén, ha egy melegvérű állat sejtjeiben, ill. testnedvében immunválaszt indukál. Antigén sajátságokkal a nagy molekulatömegű anyagok rendelkeznek. Bár az alacsony molekulatömegű anyagok is (pl. a 10–15 aminosavból álló szintetikus fehérjék) megemésztődnek és kifejezésre jutnak az APC sejt MHC molekuláján, túl kis méretűek ahhoz, hogy az APC sejt MHC molekulája és a T sejt receptora egyidejűleg felismerje őket. Egyes esetekben a kis molekulatömegű anyag antigén sajátosságát növelni lehet, ha azt kémiai úton nagyobb molekulatömegű molekulához rögzítjük (Harlow és Lane, 1988).

A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságai

Az epitóp fogalma és típusai

A vírus-köpenyfehérjének azt a (minimum 5–7 aminosavból álló) szakaszát, amely az antitesttel kapcsolatba lép, epitópnak nevezzük. Egy fehérjén egy vagy több ilyen ún. antigén tulajdonsággal rendelkező szakasz lehet. Az epitópok lépnek kölcsönhatásba az állatok által produkált antitestekkel. Az epitópok különböző típusainak a meghatározására olyan szintetikus peptideket alkalmaznak, amelyek a természetes fehérjék fragmentumai (Jerne, 1974; van Regenmortel, 1988). Az epitópoknak többféle típusa van. A véletlenszerűen összecsavarodott szerkezetű fehérjeszakasz az ún. szekvenciális epitóp. A specifikus szerkezetű fehérjeszakaszt konformációs epitópnak nevezzük, amelyen belül folyamatos (két vagy több aminosavcsoportba tartozó aminosavak kapcsolódnak egymáshoz) és megszakított (két különálló peptidlánc kapcsolódásából, vagy egyetlen összecsavarodott peptidláncból álló fehérjeszakasz) epitópokat különböztetünk meg. A kriptotópok olyan, ún. „rejtett” epitópok, melyek csak az antigén disszociációja, fragmentációja vagy denaturációja után válnak immunogénné. Ha az antitest enzimmel kapcsolt szubsztráton lép az epitóppal kölcsönhatásba, akkor neotópnak hívjuk az epitópot. A metatópok olyan epitópok, melyek a köpenyfehérjének a disszociált és a polimerizált formáján is jelen vannak. A semleges vagy neutralizációs epitópok olyan antitestek felimerésére képesek, melyek a vírus fertőzőképességét semlegesítik.

A fehérjealegységek antigén sajátosságának erőssége attól függ, hogy a molekulán hol helyezkednek el. A hidrofil aminosav-maradványok, amelyek a folyamatos epitópoknak felelnek meg, általában az antigén külső részén vannak. A hidrofób maradványok kevéssé hozzáférhetőek az immunrendszer számára, hacsak a molekula nem denaturálódik. A flexibilis (10–20 nm) mozgással rendelkező epitópok szorosabb kölcsönhatásba lépnek az antitesttel, mint a merev molekulák. Egy molekula hidrofil régiója, mely a szegmentális mobilitásért felelős, a folyamatos epitópnak felel meg. Egy molekula karboxil- és aminocsoport-végei nagyfokú mobilitást tesznek lehetővé. Ezek a terminális részek a molekula felületén elhelyezkedve tipikus folyamatos epitópokat alkotnak. A rövid aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjeszakaszok egyedülálló epitópot képviselnek a diagnosztikai elkülönítésben. Valószínűleg ezek a régiók tolerálják a DNS-mutációkat, mert feltehetőleg nem szerepelnek abban a kölcsönhatási kapcsolatban, amely a molekula összecsavarodásáért felelős (van Regenmortel, 1988).

Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusai

Az antitestek immunoglobulin-molekulák, amelyek antigén hatására az állat B limfocitáiban (nyiroksejtjeiben) termelődnek. Minden molekulán minimum kettő vagy attól több, ún. paratóp helyezkedik el, amely az antigén epitópját felismerő sajátsággal rendelkezik (Jerne, 1974). Az antitesteket két csoportba soroljuk: 1. a poliklón antitestek több mint egy epitóppal szemben reaktívak, 2. a monoklón antitestek ezzel szemben csak egy epitóppal reagálnak. A szakirodalom az antitest-molekulákat öt immunoglobulin (Ig) osztályba (IgG, IgM, IgA, IgD és IgE), illetve nyolc alosztályba (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 és IgA2) sorolja. Az IgA, IgD és IgE típusú antitestek nem olyan jelentősek, mint az IgG és az IgM antitestek, ezért ezeket a szerológiában csak ritkán alkalmazzák (Harlow és Lane, 1988).

Az IgG, IgD, IgE és az IgA antitest-molekulák mindegyike egy pár nehéz és egy pár könnyű polipeptidláncot tartalmaz (79A ábra). A láncokat diszulfid hidak vagy pl. az IgA2 esetében nem kovalens kötések tartják össze. Az IgM antitestek öt-öt pár könnyű és nehéz láncot tartalmaznak (pentamer szerkezet), míg az IgA két vagy három ilyen párból áll (Barrett, 1988; 79B és C ábra). Az IgG papainnal történő emésztése során a molekula három fragmentumra esik szét. Ezek közül két fragmentum egyforma méretű, nehéz és könnyű láncot egyaránt tartalmaz, és antigénkötő hellyel rendelkezik (Fab fragmentumok). A harmadik fragmentumnak, amely csak a nehéz láncot tartalmazza, antigénkötő helye nincs (Fc fragmentum) (79E ábra). A Fab és Fc fragmentumok közti régiót ún. „hinge” régiónak nevezzük, amely a molekula flexibilitását biztosítja, ami ahhoz szükséges, hogy a Fab szegmensek egymástól függetlenül is tudjanak működni (79D ábra). Az IgG molekula pepszinnel történő emésztése két Fab fragmentumot eredményez (amelyek egymással diszulfid híddal vannak összekötve), ezenkívül (F(ab’)2) és egy Fc’ fragmentum is keletkezik (79F ábra). A könnyű és a nehéz lánc aminoterminális részén 3–3, híd vagy keret (Fw: framework) által összekapcsolt determináns régió helyezkedik el. Ezek a CDR rövidítéssel illetett helyek (CDR: complementary determining region), és bizonyos mértékig a Fw-k is, a paratópon belül felelősek az antigénhez való kapcsolódásért. A CDR régiók aminosavsorrendje az antigéntől függően változik, ezért ezeket hipervariábilis résznek is hívjuk (79D ábra). A CDR és a Fw régiókon kívül eső rész kevéssé változik egy osztályon, ill. alosztályon belül, ezért ezeket konstans régióknak is nevezzük.

79. ábra - Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás után [Hampton et al., 1990 után]

Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás után [Hampton et al., 1990 után]


Az immunizált állatokban elsődleges immunválaszként IgM antitestek képződnek, amelynek koncentrációja a szérumban az immunizálás után 10 nap múlva éri el a maximumát, aztán csökken. Ha az antigén sikeresen indukálja a T sejtek válaszreakcióját, akkor ezután kb. két hét múlva IgG antitestek képződnek, a maximális koncentrációban. Ha ugyanazt az állatot másodszorra is immunizáljuk, akkor az IgM- és az IgG-képződéshez szükséges idő ugyanannyi lesz, mint az első immunválasz során, bár az IgG koncentrációja magasabb lesz (Barrett, 1988). Ha az MHC molekulák inkompatibilisek egy antigénnel szemben, akkor csak IgM antitestek fognak képződni.

Antigén–antitest kölcsönhatások

Az antigén és az antitestek között hidrogénhidak, ionos kötések, elektrosztatikus vonzóerők, Coulomb-, hidrofób és van der Waal’s erők által létesül kapcsolat (Harlow és Lane, 1988; Sheriff et al., 1987; van Regenmortel, 1988).

A kapcsolódás reverzíbilis, és az affinitás erőssége a hőmérséklettől, a pH-tól és az oldhatósági viszonyoktól függ. Ha ezek a körülmények változnak, az ugyanazon antigénnel és antitesttel végzett vizsgálatok (pl. ELISA) eltérő eredményeket adnak. A stabil, ill. fél-reverzíbilis immunkomplexek az antigén és az antitest közötti többszörös kölcsönhatás eredményeként jönnek létre. A stabil immunkomplexek kialakításának képességét aviditásnak nevezzük. Az IgM típusú antitestek a 10 paratópjukkal többszörös kapcsolat kialakítását teszik lehetővé, és nagyobb antigén-aviditással rendelkeznek, mint az IgG antitestek a maguk két paratópjával (79A és C ábra). Az antitest egy paratópja alacsony affinitású egy antigénnel szemben. Ha ez a gyenge kölcsönhatás megszűnik, akkor az antitest megmaradó paratópjai a közeli epitópokhoz kötődnek és stabilizálják az antitest–antigén komplexet. Az alacsony affinitású IgM antitestnek még marad 9 paratópja, míg az alacsony affinitású IgG antitestnek csak egy paratópja marad az antitest–antigén komplexek stabilizálásához. Ebből következik, hogy az IgM antitestek, amelyek gyenge kapcsolatba lépnek több antigénnel, kevésbé specifikusak, mint az IgG antitestek, mivel az IgM antitesteknek nagyobb kapacitásuk van ahhoz, hogy az antigén–antitest kapcsolatot stabilizálják. Ezért egy ugyanolyan antigén-specifitással és gyenge affinitással rendelkező IgG nem marad kötődve az antigénhez, és ezért nem mutatható ki úgy, mint az IgM antitest. Az antitest paratópját felépítő nehéz és könnyű lánc hipervariábilis régiójához az antigén úgy kapcsolódik, mint ahogyan a kulcs (antigén) illik a zárba (antitest) (Harlow és Lane, 1988). A röntgenkristálytan módszerével az antitest–antigén komplex háromdimenziós szerkezetét már feltárták (Amitt et al., 1986; Colman et al., 1987; Sheriff et al., 1987).