Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Poliklón antitestek előállítása

Poliklón antitestek előállítása

A szerológiai diagnosztikában a monoklón és a poliklón antitestek közül választhatunk. A poliklón antitestek előállítása egyszerűbb és a fajlagosságot növelni lehet, ha az antigén tisztaságát fokozzuk. Mind a poliklón, mind pedig a monoklón antitestek keresztreakcióba léphetnek heterológ antigénekkel, vagy pedig annyira specifikusak, hogy az ugyanazon vírus eltérő törzseiből származó heterológ antigéneket sem ismerik fel. Azt, hogy poliklón, ill. monoklón antitesteket használjunk, a vizsgálatok típusa és célja dönti el. A poliklón antiszérumok az antitestek változatos fajlagosságú vegyes populációját tartalmazzák, és ezért az antitest-populációk különböző részei lehetnek reaktívak a különböző szerológiai tesztek során. Ezzel szemben a monoklón antitestek csak egyféle típusú és specifitású homogén populációt tartalmaznak, így a tesztekben csak egyféleképpen reagálnak. Meg kell azonban jegyezni, hogy a túlzott érzékenység hátrányos is lehet, pl. ha a vírusban kis változás történik, és ez a változás éppen azt az antigén-determinánst érinti, amely ellen a hibridómasejt az antitestet termeli. Ekkor a vírus felismerése elmarad, holott az a növényi mintában jelen van.

A kísérleti állat kiválasztása

Bármely melegvérű állatban (patkány, egér, tengerimalac, nyúl, csirke) immunszérum képződhet. A patkánynak, az egérnek és a tengerimalacnak kevés a széruma. A csirkék testhőmérséklete magas, és az a vélemény, hogy a csirkeszérum esetében az antigén–antitest-reakcióhoz magas ozmolaritás szükséges, és ilyen körülmények között az antigén károsodhat. A nagyobb testű állatok (pl. birka, kecske, ló) véréből nagyobb mennyiségű szérum nyerhető, de az immunizáláshoz több antigénre van szükség. Immunizálásra a leggyakrabban nyulakat alkalmaznak, mert kis mennyiségű antigénre is magas titerértékű, megfelelő mennyiségű szérumot lehet nyerni belőlük. Ha az antigéneket kicsapatjuk (pl. az agargél diffúziós módszer esetében), akkor a csirkék, a nyulak és a lovak a legjobb szérumforrások, míg a tengerimalac, a patkány és az egér nem megfelelő. A csirke és a nyúl antiszéruma sokféle koncentrációban ad precipitációs reakciót, míg a juh és a kecske antiszéruma csak szűkebb koncentrációjú tartományban. Egy szérum előállításakor legalább ugyanazon faj két egyedét szükséges ugyanazzal az antigénnel immunizálni.

Az immunizálás

Az immunizálásra használt antigén mennyisége függ az antigén sajátságaitól, az antigén előkészítésétől és a beoltás módszereitől. A hosszú ideig tartó immunizálási folyamatnál, ahol nagy mennyiségű antigénre van szükség, többféle és nagyobb mennyiségű antitestek képződnek, mint a rövidebb ideig tartó immunizálásnál, de az antitestek alacsonyabb specifitásúak. Az immunizálásra gyakran kombinált injektálási módszereket alkalmaznak. Általában az intravénás és az intramuszkuláris befecskendezés kombinációját alkalmazzák egy 5–7 hétig tartó immunizálási folyamat során. Az intravénás injektálás után az antitest ugyan gyorsabban szétterjed, de a szervezet védekező mechanizmusa folytán a véráramban gyorsan hatástalanná válik. Ezért több mint 8 intravénás injekció kell ahhoz, hogy a szérum a megfelelő koncentrációban tartalmazza az antitesteket.

Célszerű a pufferben lévő antigént ún. Freund-féle adjuvánssal 1:1 arányban emulgeálni intramuszkuláris injektálás céljából. Az adjuváns paraffinolajat és emulgeálószert (mannid monooleát) is tartalmaz. A komplett Freund-adjuváns hő által elölt baktériumokat is tartalmaz (Mycobacterium tuberculosis, M. butyricum, ill. egyéb, savnak ellenálló fajokat), míg az inkomplett adjuvánsban nincsenek baktériumok. Az adjuváns feladata, hogy stabilizálja és raktározza az antigént az izomszövetben, ezért nagyobb mennyiségű antitest képződésével számolhatunk, mint ha ugyanolyan mennyiségű antigént vizes fázisban fecskendeztünk volna be az állatba. A leggyakrabban alkalmazott Freund-adjuvánson kívül egyéb adjuvánsok használata is lehetséges, és újabban jelentős eredmények születtek az adjuvánskutatás terén (Hampton et al., 1990).

Injektálási módszerek

Alapvetően hatféle befecskendezési módszert különböztetünk meg:

  1. Intravénás (nyúlnál a fülén lévő marginális érbe, csirkénél a szárnyba, egérnél a farok-főérbe).

  2. Intramuszkuláris (nyúlnál a lábikra vagy a comb izomzatába, csirkénél a lábba, ill. a mellizomzatba).

  3. Hasnyálmirigybe (egérnél ez a módszer a legjobb).

  4. Bőr alá (nyúl).

  5. Bőrbe (nyúl).

  6. Talpba (nyúl).

A vírussal történő immunizálás során a megfelelő mennyiségű antitestképzéshez csirkében és nyúlban általában 2 intramuszkuláris és egy intravénás injekció szükséges, hetente 1–2 mg antigén mennyiségben. Az antiszérum maximális titerértéke az első injektálás után vírustól függően változik, de legtöbbször 5–7 hét múlva várható. A titerérték az antiszérum azon jellemző sajátossága, amely megmutatja azt, hogy az antiszérumot meddig hígíthatjuk folyamatosan a kétszeresére, hogy még látható precipitációt kapjunk az antigénnel történő reakció során.

A befecskendezni kívánt antigén mennyiségét csak akkor célszerű növelni, ha a titerérték hirtelen csökken. Túlzott mennyiségű antigén használata a titerértéket nem növeli meg jelentősen. E célból előnyösebb az injektálásának, illetve az antigén stabilizálásának a módján változtatni.

Vérvétel és szérumnyerés

Vérvétel előtt 12–18 órával az állatokat éheztetni kell, hogy a lipidakkumulációt a vérben megakadályozzuk. Immunizálásra többnyire nyulakat használnak. A vérvétel a szívből, az artériákból és a vénákból történhet. A leggyakoribb és a legkevésbé kockázatos a fülben lévő érből kéthetente 20–20 ml vért venni. A kinyert vért egy óráig szobahőmérsékleten alvadni hagyjuk, majd 30 percig 37 °C-ra tesszük; ekkor a szérum mennyisége megnő. Egy éjszakára hűtőbe rakjuk, majd a szérumot leöntjük, ill. leszívjuk. A sejtes elemek elkülönítése céljából centrifugálás, majd szűrés következik. Ezt követi a Na-aziddal és glicerollal történő keverés, majd utána a –20 °C-on történő liofilezés.

Az IgG tisztítása az antiszérumból

Az antitestek (IgG) tisztításának többféle módja ismeretes, amelyek egymással kombinálhatók (Hampton et al., 1990). Az alkalmazott eljárások röviden a következők:

  1. Részleges tisztítás ammónium-szulfátos kicsapatással.

  2. Ioncserés kromatográfia.

  3. Protein A affinitású kromatográfia.

  4. Homológ antigén–antitest komplexekből történő disszociáció.

  5. Cukorgrádiens-centrifugálás.

  6. F(ab’)2 fragmentumok kinyerése.

  7. Magasnyomású folyadékkromatográfia (HPLC).

  8. Méretspecifikus membránon történő ultraszűrés.

  9. Gélszűrés (IgM osztályba tartozó, nagy molekulatömegű antitestek esetében).