Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Monoklón antitestek előállítása

Monoklón antitestek előállítása

A növénykórtanban a monoklón antitestek (monoclonal antibodies, Mabs) alkalmazása nem régi keletű (Stern és Gamble, 1984; Campbell, 1984; Halk és Boer, 1985). Előnyei a következők:

  1. Csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak.

  2. A kívánt fajlagosság a hibridóma-sejtvonalak sorozatvizsgálatával elérhető.

  3. A hibridóma-sejtvonalak stabilak a tenyésztés, illetve a fagyasztott tárolás során.

Kohler és Milstein (1975) vezette be azt az eljárást, amelynek lényege, hogy a lép antitestképző nyiroksejtjeit rákos myelomasejtekkel fuzionáltatva ún. hibridómákat kapunk, amelyben biztosított a specifikus antitest kiválasztása és a folyamatos növekedés. Immunizálásra egereket vagy patkányokat használnak fel. Ezen állatok vére kevés, azonban érzékenyek egy olyan tumorra, ami olyan ascites testfolyadékot produkál, amelyben annyi az antitest, mint a vérszérumban. Az ascites testfolyadék használatának előnyei a következők:

  1. Az immunizáláshoz kevés antigén szükséges.

  2. A testfolyadék mennyisége (ideális körülmények között) 20 ml.

  3. Az antitesteket ugyanúgy lehet tisztítani és tárolni, mint a szérumból kivont IgG-t.

  4. Hatékonyan alkalmazhatók egyes diagnosztikai eljárásokban, ahol a kimutatáshoz két, genetikailag különböző szérumforrásból származó antigénrendszer szükséges.

A hibridómakultúrák klónozása és további szelekciója monoklón antitesteket (Mabs) eredményez, amelyek az antigénnek csak egyetlen epitópjával szemben mutatnak aktivitást. A monoklón antitestek előállításának technikai lépései több szerző munkájában megtalálhatóak. A monoklón antitestek előállításának folyamata a 80. ábrán látható. A módszer fontosabb lépései az alábbiakban foglalhatók össze:

  1. Az egerek vagy patkányok immunizálása. Azokból az egerekből, amelyekben az antiszérum titerértéke a legmagasabb, a lépet eltávolítják, és fúzióra előkészítik.

  2. Az egér myeloma-sejtvonalainak tenyésztése. A fagyasztott myeloma-kultúrából a fúzió előtt legalább tíz nappal életképes, aktív növekedési állapotban (log fázisban) lévő sejtkultúrát kell készíteni.

  3. A lépsejtek fuzionáltatása a myelomasejtekkel.

  4. A fuzionált sejtek (hibridómák) tenyésztése szelektív táptalajon, amely a nem fuzionált sejtek növekedését gátolja.

  5. A hibridóma-kultúrák szűrése a monoklón antitestek kiválasztása céljából.

  6. A hibridómák klónozása a monoklón sejtvonalak biztosítása céljából.

  7. Ascites testfolyadék termelése.

80. ábra - A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]

A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]


A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségei

A monoklón antitestek (Mabs) felhasználhatók a különböző növénypatogének (vírusok, baktériumok, spiroplazmák, fitoplazmák) és törzseik meghatározására és jellemzésére, a patogének és az általuk kódolt termékek lokalizációjának és felhalmozódásának, valamint a kórokozók és génproduktumaik szerkezetének a jellemzésére (Goding, 1983; Adam et al., 1991; Herscheid, 1992). Jelenleg 19 víruscsoportba tartozó, több mint 60 növényvírusra készítettek monoklón antitesteket (20. táblázat).

20. táblázat - Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő (van Regenmortel és Dubs, 1993 után módosítva)

Angol név

Magyar név

Akroním

Alfalfa mosaic alfamovirus

Lucerna mozaik vírus

AMV

Apple chlorotic leaf spot trichovirus

Alma klorotikus levélfoltosság vírus

ACLSV

Apple mosaic ilarvirus

Alma mozaik vírus

ApMV

Arabis mosaic nepovirus

Arabis mozaik vírus

ArMV

Banana bunchy top nanavirus

Banán csúcscsokrosodás vírus

BBTV

Barley yellow dwarf luteovirus

Árpa sárga törpülés vírus

BYDV

Bean common mosaic potyvirus

Bab közönséges mozaik vírus

BCMV

Bean pod mottle comovirus

Babhüvely foltosság vírus

BPMV

Bean southern mosaic sobemovirus

Bab déli mozaik vírus

SBMV

Bean yellow mosaic potyvirus

Bab sárga mozaik vírus

BYMV

Beet necrotic yellow vein benyvirus

Répa nekrotikus sárgaerűség vírus

BNYVV

Beet western yellows luteovirus

Répa nyugati sárgaság vírus

BWYV

Carnation etched ring caulimovirus

Szegfű karcolatos gyűrűs vírus

CERV

Carnation latent carlavirus

Szegfű látens vírus

CLV

Carnation mottle carmovirus

Szegfű foltosság vírus

CarMV

Carnation necrotic fleck closterovirus

Szegfű nekrotikus foltosság vírus

CNFV

Cassava African mosaic bigeminivirus

Manióka afrikai mozaik vírus

CAMV

Citrus tristeza closterovirus

Citrus tristeza vírus

CTV

Citrus variegation ilarvirus

Citrus tarkaság vírus

CVV

Clover yellow vein potyvirus

Here sárga erűség vírus

ClYVV

Cowpea mosaic comovirus

Tehénborsó mozaik vírus

CPMV

Cowpea severe mosaic comovirus

Tehénborsó súlyos mozaik vírus

CPSMV

Cucumber green mottle mosaic tobamovirus

Uborka zöldfoltosság mozaik vírus

CGMMV

Cucumber mosaic cucumovirus

Uborka mozaik vírus

CMV

Grapevine fanleaf nepovirus

Szőlő páfránylevelűség vírus

GFLV

Lettuce mosaic potyvirus

Saláta mozaik vírus

LMV

Maize dwarf mosaic potyvirus

Kukorica törpülés mozaik vírus

MDMV

Maize streak mastrevirus

Kukorica csíkosság vírus

MSV

Odontoglossum ringspot tobamovirus

Odontoglossum gyűrűsfoltosság vírus

ORSV

Papaya ringspot potyvirus

Papaya gyűrűsfoltosság vírus

PRSV

Pea severe mosaic potyvirus

Borsó súlyos mozaik vírus

PeSMV

Peanut clump pecluvirus

Földimogyoró bokrosodás vírus

PCV

Peanut mottle potyvirus

Földimogyoró foltosság vírus

PeMoV

Plum pox potyvirus

Szilva himlő vírus

PPV

Potato leaf roll polerovirus

Burgonya levélsodródás vírus

PLRV

Potato A potyvirus

Burgonya A-vírus

PVA

Potato M carlavirus

Burgonya M-vírus

PVM

Potato X potexvirus

Burgonya X-vírus

PVX

Potato Y potyvirus

Burgonya Y-vírus

PVY

Prune dwarf ilarvirus

Szilva törpülés vírus

PDV

Prunus necrotic ringspot ilarvirus

Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus

PNRSV

Raspberry bushy dwarf idaeovirus

Málna bokros törpülés vírus

RBDV

Rice dwarf phytoreovirus

Rizs törpülés vírus

RDV

Rice ragged stunt oryzavirus

Rizs érdes törpülés vírus

RRSV

Rice stripe tenuivirus

Rizs csíkosság vírus

RSV

Satsuma dwarf nepovirus

Satsuma törpülés vírus

SDV

Soybean dwarf luteovirus

Szójabab törpülés vírus

SbDV

Soybean mosaic potyvirus

Szójabab mozaik vírus

SMV

Sweet clover necrotic mosaic dianthovirus

Here nekrotikus mozaik vírus

SCNMV

Tobacco etch potyvirus

Dohány karcolatos vírus

TEV

Tobacco mosaic tobamovirus

Dohány mozaik vírus

TMV

Tobacco necrotic dwarf luteovirus

Dohány nekrotikus törpülés vírus

TNDV

Tobacco streak ilarvirus

Dohány csíkosság vírus

TSV

Tomato mosaic tobamovirus

Paradicsom mozaik vírus

ToMV

Tomato ringspot nepovirus

Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus

ToRSV

Tomato spotted wilt tospovirus

Paradicsom bronzfoltosság vírus

TSWV

Tulip breaking potyvirus

Tulipán színtörés vírus

TBV

Watermelon mosaic 2 potyvirus

Görögdinnye mozaik 2-vírus

WMV-2

Wheat soil-borne mosaic furovirus

Búza talajlakó mozaik vírus

SBWMV

Zucchini yellow mosaic potyvirus

Cukkini sárga mozaik vírus

ZYMV


A Mabs-ok alkalmazhatók a vírusok mennyiségi és minőségi meghatározására, a vírusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására csakúgy, mint a strukturális és nem strukturális génproduktomok szerkezeti és funkcionális tanulmányozására. Alkalmazhatók vírusok, vírustörzsek és szerotípusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges törzse ellen készült Mab segítségével további tíz, a tobamovirusokhoz tartozó vírust sikerült elkülöníteni (Briand et al., 1982). Tekintettel arra, hogy a monoklón antitestek csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak, kitűnően alkalmazhatók az antigénszerkezet molekuláris szintű tanulmányozására (Altschuh et al., 1985). A Mab segítségével lehetővé válik az epitópok azonosítása, szerkezetük feltérképezése. Mab-ot használtak pl. a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus), valamint a dohány mozaik vírus szerkezetének a tanulmányozására, valamint a potyvirusok, az ilarvirusok és a tobamovirusok specifikus epitópjainak a meghatározására. Jelenleg már nemcsak a vírus-köpenyfehérjével szemben készülnek monoklón antitestek, hanem pl. nukleáris zárványokkal, henger alakú zárványfehérjékkel, amorf zárványokkal, és potyvirusok esetében a levéltetű-átvitelért felelős, ún. helper komponensekkel szemben is.