Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek
dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard
Mezőgazda Kiadó
A növénykórtanban a monoklón antitestek (monoclonal antibodies, Mabs) alkalmazása nem régi keletű (Stern és Gamble, 1984; Campbell, 1984; Halk és Boer, 1985). Előnyei a következők:
Csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak.
A kívánt fajlagosság a hibridóma-sejtvonalak sorozatvizsgálatával elérhető.
A hibridóma-sejtvonalak stabilak a tenyésztés, illetve a fagyasztott tárolás során.
Kohler és Milstein (1975) vezette be azt az eljárást, amelynek lényege, hogy a lép antitestképző nyiroksejtjeit rákos myelomasejtekkel fuzionáltatva ún. hibridómákat kapunk, amelyben biztosított a specifikus antitest kiválasztása és a folyamatos növekedés. Immunizálásra egereket vagy patkányokat használnak fel. Ezen állatok vére kevés, azonban érzékenyek egy olyan tumorra, ami olyan ascites testfolyadékot produkál, amelyben annyi az antitest, mint a vérszérumban. Az ascites testfolyadék használatának előnyei a következők:
Az immunizáláshoz kevés antigén szükséges.
A testfolyadék mennyisége (ideális körülmények között) 20 ml.
Az antitesteket ugyanúgy lehet tisztítani és tárolni, mint a szérumból kivont IgG-t.
Hatékonyan alkalmazhatók egyes diagnosztikai eljárásokban, ahol a kimutatáshoz két, genetikailag különböző szérumforrásból származó antigénrendszer szükséges.
A hibridómakultúrák klónozása és további szelekciója monoklón antitesteket (Mabs) eredményez, amelyek az antigénnek csak egyetlen epitópjával szemben mutatnak aktivitást. A monoklón antitestek előállításának technikai lépései több szerző munkájában megtalálhatóak. A monoklón antitestek előállításának folyamata a 80. ábrán látható. A módszer fontosabb lépései az alábbiakban foglalhatók össze:
Az egerek vagy patkányok immunizálása. Azokból az egerekből, amelyekben az antiszérum titerértéke a legmagasabb, a lépet eltávolítják, és fúzióra előkészítik.
Az egér myeloma-sejtvonalainak tenyésztése. A fagyasztott myeloma-kultúrából a fúzió előtt legalább tíz nappal életképes, aktív növekedési állapotban (log fázisban) lévő sejtkultúrát kell készíteni.
A lépsejtek fuzionáltatása a myelomasejtekkel.
A fuzionált sejtek (hibridómák) tenyésztése szelektív táptalajon, amely a nem fuzionált sejtek növekedését gátolja.
A hibridóma-kultúrák szűrése a monoklón antitestek kiválasztása céljából.
A hibridómák klónozása a monoklón sejtvonalak biztosítása céljából.
Ascites testfolyadék termelése.
80. ábra - A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]
![A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]](kepek/080-nvir.jpg)
A monoklón antitestek (Mabs) felhasználhatók a különböző növénypatogének (vírusok, baktériumok, spiroplazmák, fitoplazmák) és törzseik meghatározására és jellemzésére, a patogének és az általuk kódolt termékek lokalizációjának és felhalmozódásának, valamint a kórokozók és génproduktumaik szerkezetének a jellemzésére (Goding, 1983; Adam et al., 1991; Herscheid, 1992). Jelenleg 19 víruscsoportba tartozó, több mint 60 növényvírusra készítettek monoklón antitesteket (20. táblázat).
20. táblázat - Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő (van Regenmortel és Dubs, 1993 után módosítva)
Angol név | Magyar név | Akroním |
Alfalfa mosaic alfamovirus | Lucerna mozaik vírus | AMV |
Apple chlorotic leaf spot trichovirus | Alma klorotikus levélfoltosság vírus | ACLSV |
Apple mosaic ilarvirus | Alma mozaik vírus | ApMV |
Arabis mosaic nepovirus | Arabis mozaik vírus | ArMV |
Banana bunchy top nanavirus | Banán csúcscsokrosodás vírus | BBTV |
Barley yellow dwarf luteovirus | Árpa sárga törpülés vírus | BYDV |
Bean common mosaic potyvirus | Bab közönséges mozaik vírus | BCMV |
Bean pod mottle comovirus | Babhüvely foltosság vírus | BPMV |
Bean southern mosaic sobemovirus | Bab déli mozaik vírus | SBMV |
Bean yellow mosaic potyvirus | Bab sárga mozaik vírus | BYMV |
Beet necrotic yellow vein benyvirus | Répa nekrotikus sárgaerűség vírus | BNYVV |
Beet western yellows luteovirus | Répa nyugati sárgaság vírus | BWYV |
Carnation etched ring caulimovirus | Szegfű karcolatos gyűrűs vírus | CERV |
Carnation latent carlavirus | Szegfű látens vírus | CLV |
Carnation mottle carmovirus | Szegfű foltosság vírus | CarMV |
Carnation necrotic fleck closterovirus | Szegfű nekrotikus foltosság vírus | CNFV |
Cassava African mosaic bigeminivirus | Manióka afrikai mozaik vírus | CAMV |
Citrus tristeza closterovirus | Citrus tristeza vírus | CTV |
Citrus variegation ilarvirus | Citrus tarkaság vírus | CVV |
Clover yellow vein potyvirus | Here sárga erűség vírus | ClYVV |
Cowpea mosaic comovirus | Tehénborsó mozaik vírus | CPMV |
Cowpea severe mosaic comovirus | Tehénborsó súlyos mozaik vírus | CPSMV |
Cucumber green mottle mosaic tobamovirus | Uborka zöldfoltosság mozaik vírus | CGMMV |
Cucumber mosaic cucumovirus | Uborka mozaik vírus | CMV |
Grapevine fanleaf nepovirus | Szőlő páfránylevelűség vírus | GFLV |
Lettuce mosaic potyvirus | Saláta mozaik vírus | LMV |
Maize dwarf mosaic potyvirus | Kukorica törpülés mozaik vírus | MDMV |
Maize streak mastrevirus | Kukorica csíkosság vírus | MSV |
Odontoglossum ringspot tobamovirus | Odontoglossum gyűrűsfoltosság vírus | ORSV |
Papaya ringspot potyvirus | Papaya gyűrűsfoltosság vírus | PRSV |
Pea severe mosaic potyvirus | Borsó súlyos mozaik vírus | PeSMV |
Peanut clump pecluvirus | Földimogyoró bokrosodás vírus | PCV |
Peanut mottle potyvirus | Földimogyoró foltosság vírus | PeMoV |
Plum pox potyvirus | Szilva himlő vírus | PPV |
Potato leaf roll polerovirus | Burgonya levélsodródás vírus | PLRV |
Potato A potyvirus | Burgonya A-vírus | PVA |
Potato M carlavirus | Burgonya M-vírus | PVM |
Potato X potexvirus | Burgonya X-vírus | PVX |
Potato Y potyvirus | Burgonya Y-vírus | PVY |
Prune dwarf ilarvirus | Szilva törpülés vírus | PDV |
Prunus necrotic ringspot ilarvirus | Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus | PNRSV |
Raspberry bushy dwarf idaeovirus | Málna bokros törpülés vírus | RBDV |
Rice dwarf phytoreovirus | Rizs törpülés vírus | RDV |
Rice ragged stunt oryzavirus | Rizs érdes törpülés vírus | RRSV |
Rice stripe tenuivirus | Rizs csíkosság vírus | RSV |
Satsuma dwarf nepovirus | Satsuma törpülés vírus | SDV |
Soybean dwarf luteovirus | Szójabab törpülés vírus | SbDV |
Soybean mosaic potyvirus | Szójabab mozaik vírus | SMV |
Sweet clover necrotic mosaic dianthovirus | Here nekrotikus mozaik vírus | SCNMV |
Tobacco etch potyvirus | Dohány karcolatos vírus | TEV |
Tobacco mosaic tobamovirus | Dohány mozaik vírus | TMV |
Tobacco necrotic dwarf luteovirus | Dohány nekrotikus törpülés vírus | TNDV |
Tobacco streak ilarvirus | Dohány csíkosság vírus | TSV |
Tomato mosaic tobamovirus | Paradicsom mozaik vírus | ToMV |
Tomato ringspot nepovirus | Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus | ToRSV |
Tomato spotted wilt tospovirus | Paradicsom bronzfoltosság vírus | TSWV |
Tulip breaking potyvirus | Tulipán színtörés vírus | TBV |
Watermelon mosaic 2 potyvirus | Görögdinnye mozaik 2-vírus | WMV-2 |
Wheat soil-borne mosaic furovirus | Búza talajlakó mozaik vírus | SBWMV |
Zucchini yellow mosaic potyvirus | Cukkini sárga mozaik vírus | ZYMV |
A Mabs-ok alkalmazhatók a vírusok mennyiségi és minőségi meghatározására, a vírusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására csakúgy, mint a strukturális és nem strukturális génproduktomok szerkezeti és funkcionális tanulmányozására. Alkalmazhatók vírusok, vírustörzsek és szerotípusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges törzse ellen készült Mab segítségével további tíz, a tobamovirusokhoz tartozó vírust sikerült elkülöníteni (Briand et al., 1982). Tekintettel arra, hogy a monoklón antitestek csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak, kitűnően alkalmazhatók az antigénszerkezet molekuláris szintű tanulmányozására (Altschuh et al., 1985). A Mab segítségével lehetővé válik az epitópok azonosítása, szerkezetük feltérképezése. Mab-ot használtak pl. a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus), valamint a dohány mozaik vírus szerkezetének a tanulmányozására, valamint a potyvirusok, az ilarvirusok és a tobamovirusok specifikus epitópjainak a meghatározására. Jelenleg már nemcsak a vírus-köpenyfehérjével szemben készülnek monoklón antitestek, hanem pl. nukleáris zárványokkal, henger alakú zárványfehérjékkel, amorf zárványokkal, és potyvirusok esetében a levéltetű-átvitelért felelős, ún. helper komponensekkel szemben is.