dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard
Mezőgazda Kiadó
Az elnevezés onnan származik, hogy ha megfelelő mennyiségű antigén és antitest találkozik egymással, akkor a reakció látható csapadékképződésben nyilvánul meg. A növényi minta szövetnedvét összekeverjük az antiszérummal. Az inkubálás után szabad szemmel vagy mikroszkóppal értékelünk. Amennyiben az antigén (azaz a keresett vírus) jelen volt a szövetnedvben, akkor az antigén–antitest reakció következtében apró pelyhekből álló csapadék keletkezik. A precipitációs tesztek a legrégebben alkalmazott eljárások az antigén–antitest kölcsönhatások tanulmányozására (Heidelberger és Kendall, 1935; Kleczkowski, 1966). A precipitáció és az agglutináció elkülönítése a reagáló antigén mérete alapján történik. A precipitáció a makromolekulák és a vírusrészecskék oldhatatlanságára utal, míg az agglutináció a sejtek, ill. a hozzá hasonló méretű részecskék összetömörülését jelenti.
Folyékony közegben történő precipitációs teszt
Az antiszérumból megfelelő pufferrel hígítási sorozatot készítünk.
0,5 ml antiszérumot ugyanannyi mennyiségű növényi szövetnedvvel kémcsőben összekeverünk és vízfürdőben 25–40 °C-on inkubálunk.
Az a legmagasabb hígítási érték, amelynél az antiszérum a neki megfelelő, ismert koncentrációjú antigénnel reagálva még látható precipitációt mutat, az antiszérum titerértékeként ismert és az inkubálás után egy, ill. két órával meghatározható. A precipitációt láthatóbbá lehet tenni, ha a kémcsövet fekete hátterű fényforrás elé helyezzük.
A precipitációs tesztek eredményességét számos tényező befolyásolja. Fontos tényező az antigén mérete. A fonál alakú, 500–1000 nm hosszúságú vírusrészecskék már kisebb mennyiségű antitesttel is jól látható precipitációt eredményeznek, mint a kisebb (izometrikus) virionok vagy a disszociált fehérjealegységek (Van Slogteren és Dubs, 1993). A titerérték általában 10–3, ill. 10–4 a fonál alakú vírusoknál, míg a disszociált vírusalegységeknél ritkán magasabb, mint 10–2.
Az antigén–antitest reakció kémcső helyett lejátszódhat tárgylemezen, vagy Petri-csészében is (Wetter, 1965; Noordam, 1973; Dijkstra és De Jager, 1998). Ezek az ún. mikroprecipitációs tesztek. Tárgylemez használata esetén az üvegfelületet hidrofóbbá kell tenni szilikonnal vagy 0,1%-os formvarral. Ha a reakció Petri-csészében történik, akkor az evaporáció elkerülése végett ásványi olajat kell rétegezni a felületre. A lemezeket nedves kamrában kell tartani. A csapadékképződést szobahőmérsékleten 0,5–1 órás inkubálás után mikroszkóppal lehet megfigyelni. 4 °C-on hosszabb, mintegy 6 órás inkubációs idő szükséges. A mikroprecipitáció cseppben történő lejátszódásának fő előnye a reagensek gazdaságos felhasználása.
A precipitációs tesztek másik altípusa az, mikor az antiszérum 10–30%-os glicerines sóoldatban hígítva egy kis kémcső aljára kerül, amire úgy rétegzik rá az antigént, hogy a kettő között éles határfelület képződjön. Pozitív reakció esetén a határfelületen precipitációs gyűrű alakul ki. E módszer előnye, hogy a reagensek koncentrációja kevéssé kritikus. Többféle vírus kimutatására sikeresen alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).
A precipitációs teszteket vagy tisztított víruspreparátummal végzik, vagy a fertőzött növény leszűrt szövetnedvével. Ha a vírus a gazdanövényében csak nagyon kis koncentrációban van jelen, akkor szükséges a növényi szövetnedvet ultracentrifugálással koncentrálni.
A folyadékprecipitációs tesztek fő alkalmazási területe az antiszérum-titerérték segítségével a vírusok jellemzése és a nagyméretű, immundiffúziós tesztekkel nem tanulmányozható vírusok közötti szerológiai rokonság felderítése. Két vírus közötti rokonsági kapcsolat kimutatására jól használható az ún. szerológiai differenciálindex (SDI).
Az agglutinációs reakciókban az antigént vagy az antitestet a vörösvérsejtek vagy egyéb hordozórészecskék, pl. latex szemcsék felületére kötik. Ebben az esetben a sejtek és a latex partikulák mérete miatt látható szerológiai reakció képződik még akkor is, ha a reagensek alacsony koncentrációja a látható precipitációt nem tenné lehetővé. A passzív hemagglutináció esetében a vírusrészecskék vagy az antitestek a vörösvérsejtekhez különböző kémiai kezelések által kötődnek (Rajeshwari et al., 1981; van Regenmortel, 1982), míg a latex tesztnél az antitest egyszerű adszorpcióval kötődik a latex partikulákhoz. Ezért a vírussal (antigénnel) történő pozitív reakció esetén a latex szemcsével megnövelt antitest és a vírusrészecskék aggregálódása következtében a precipitáció láthatósága megnövekszik. Az antitest-molekulák a latex szemcsékhez egy ún. protein A közbülső réteggel is kapcsolódhatnak (Torrance, 1980). Az agglutinációs tesztek érzékenysége 2–3-szor nagyobb, mint a precipitációs vagy az immunodiffúziós teszteké (van Regenmortel, 1982). A zselatinból és különböző színű gumiarábikumból készült, 3 μm átmérőjű zselatinszemcsék szintén sikerrel alkalmazhatók a növényi vírusok kimutatásában.
Az immunodiffúziós tesztek gélben lejátszódó precipitációs tesztek. Két fő változatuk ismert.
Az egyszerű géldiffúzió esetében az antigén diffundál abba a közegbe, amely az antitestet tartalmazza. Az immunodiffúziós teszteknek a növényi virológiában leggyakrabban használt változata a kettős (dupla) géldiffúzió, amelyben mind az antigén, mind pedig az antitest gélközegbe vágott különálló lyukakban helyezkedik el és egymás felé diffundál (Shepard, 1972). Az immuno-elektronmikroszkópos módszer az immunodiffúziós teszteket és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat együtt tartalmazza. Ezt a módszert részletesen az Immuno-elektronmikroszkópos módszer c. fejezet tárgyalja.
Egyszerű géldiffúzió
A reakció kb. 1 cm-es átmérőjű és 7–8 cm hosszú kémcsőben zajlik le. A kémcső aljára kerül az antiszérummal kevert agar vagy agaróz (szilárd fázis), rárétegezve pedig az antigén folyékony fázisban. A precipitációs gyűrű a kémcső alja felé mozdul el. A mozgás sebessége az antigén diffúziós állandójától, valamint az antigén és az antitest koncentrációjától függ. A többszörös zónák kialakulása különböző antigén-komponensek jelenlétére utal (Oudin, 1952).
Radiál géldiffúzió
Az egyszerű diffúzió másik változata a sugárirányú, ún. radiális géldiffúzió (Vaerman, 1981), ahol az antigén egy központi lyukban helyezkedik el, és az azt körülvevő, antitestet tartalmazó agargélbe diffundál. A lyuk körüli precipitációs gyűrű vastagsága az antigén koncentrációjával arányos.
Kettős géldiffúzió
Az immunodiffúziós tesztek közül a növényvirológiában leggyakrabban az Ouchterlony-féle (1968) kettős diffúziós módszert alkalmazzák. Ennek az a lényege, hogy vékony agarlemezbe lyukakat vágunk úgy, hogy egy középső lyukat 6–8 másik lyuk vegyen körül. A középső lyukba antiszérumot cseppentünk, míg a szélsőkbe a vizsgálandó növényi minták szövetnedvei kerülnek. Az antitestek és az antigének is diffundálnak az agarban. Ahol találkoznak, ott az agarban félhold alakú precipitációs ív keletkezik. A módszer izometrikus és pálcika alakú vírusokra alkalmazható. A hosszú, fonál alakú vírusokat előbb olyan kezelésnek kell alávetni, amely biztosítja a köpenyfehérjék szabad diffúzióját. Miután a reagensek a lyukakba kerültek, az antigén diffúziós együtthatójától függően a diffúzió 24–72 óráig tart. A párolgás gátlása céljából a Petri-csészét nedves kamrában tartjuk, vagy a gél tetejére könnyű ásványi olajréteget helyezünk. A precipitációs ívek a Petri-csészét megvilágítva sötét háttér előtt tisztán látszódnak.
Precipitációs minták
Ha a lyukakban a reagensek megfelelő arányban vannak, akkor a precipitációs ív helyzete és görbülete utal az antigén méretére. Ha az antigén diffúziós koefficiense ugyanakkora, mint az antitestté (5 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív egyenes lesz, és egyforma távolságra helyezkedik el a két lyuktól. Ha a vírusrészecskék diffúziós együtthatója alacsonyabb (0,3–1,6 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív az antigén lyukhoz közel helyezkedik el, és körbefogja azt (van Regenmortel, 1982). Ha két egymás mel-lett elhelyezkedő antigén diffundál ugyanazon antitestforrás felé, akkor a precipitációs ívek találkozásánál különböző minták alakulhatnak ki. Három alapváltozat lehetséges: 1. egybeolvadó (koaleszcens), 2. ívek kereszteződése és 3. sarkantyúképzés (spur), amelyek a két vírus közötti rokonsági kapcsolat meghatározására jól használhatók. Ha a precipitációs ívek összeérnek (koaleszcens minta), akkor a két egymás melletti lyukban elhelyezkedő vírus szerológiailag azonos. Ha a két precipitációs ív keresztezi egymást, a két vírus nincs egymással rokonsági kapcsolatban. A sarkantyú- vagy spurképződés arra utal, hogy a két összehasonlítandó vírus azonos, de különböző epitópokat is tartalmaz (81. ábra).
81. ábra - A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990 után]
Az Ouchterlony-technika alkalmazása Na-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében
A fonál alakú vírusok hosszúságuknak és aggregálódó képességüknek megfelelően a 0,5–1,0%-os agargélben nem diffundálnak. Ahhoz, hogy a gélben történő diffúziót lehetővé tegyük, a részecskéket ultrahanggal össze kell törni, vagy kémiai úton, alkáli pufferrel, detergensekkel, pirrolidinnel vagy nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kell szétbontani (Purcifull és Batchelor, 1977). Az SDS-t vagy a gélbe keverik, vagy összekeverik az antigénnel, hogy megkönnyítsék a disszociációt. Az eljárást Gooding és Bing (1970) dolgozta ki a hosszú, fonál alakú vírusokra, de ma már más morfológiájú vírusokra, valamint fehérje-zárványtestek detektálására is alkalmazható.
A disszociált köpenyfehérje-alegységek már könnyen diffundálnak, és így lehetővé válik bármely méretű vírus esetében az immunodiffúziós tesztek alkalmazása. A különböző vírusok disszociált alegységei szerológiailag szorosabb rokonságot mutatnak, mint az intakt vírusok, ezért ezzel a megközelítéssel a rokon vírusok vagy vírustörzsek között további keresztreakciókat lehet kimutatni (Shepard et al., 1974; Dijkstra és De Jager, 1998).
A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) meghatározása Ouchterlony-módszerrel SDS jelenlétében (Purcifull és Batchelor, 1977)
Az agar előkészítése: A közeg 0,8% agart, 1% NaN3-t és 0,5% SDS-t tartalmaz. 4 g agarhoz 300 ml desztillált vizet adunk és 5 perc alatt 100 °C-on felolvasztjuk. A felolvasztott agarhoz 5 g nátrium-azidot (NaN3) adunk és jól összekeverjük. 2,5 g SDS-t 100 ml forró desztillált vízben feloldunk, ezt hozzáadjuk az agaroldathoz. A keveréket 500 ml-ig forró desztillált vízzel kiegészítjük és összekeverjük. 11 cm átmérőjű Petri-csészébe 12–12 ml oldatot öntünk. Miután az agar megszilárdult, a Petri-csészéket 4 °C-on nedves kamrában tároljuk.
Az antigén előkészítése: A fertőzött és az egészséges növény levelét desztillált vízzel 1:1 arányban homogenáljuk, majd minden gramm levélszövethez 1 ml 3%-os SDS-t adunk. A mintát gézen átszűrjük.
Az antiszérum előkészítése: A potyvirusok esetében az SDS-sel nem kezelt vírussal történő immunizálás is jó eredményt ad. Az antiszérumot általában nem hígítjuk, de ha mégis szükséges, akkor vagy a PBS-pufferrel, vagy 0,05 M Tris-HCl-lel (pH:7,2), amely 0,85% NaCl-ot és 5% bovin-szérumalbumint is tartalmaz.
Az agarba lyukvágóval 7 mm átmérőjű lyukakat vágunk. Egy centrális lyuk körül 6 db perifériális lyuk legyen egymástól 4–5 mm-re. A középső lyukba az antiszérum, a szélsőkbe pedig a növényi minták kerülnek.
Az inkubálás 24 °C-on történik, és az eredményeket 24–48 óra múlva feljegyezzük. A nem specifikus, nem antigén–antitest reakció következtében létrejövő precipitációs ívek kialakulása elkerülhető, ha a gélközeghez bovin-szérumalbumint is adunk.
Az immunoelektroforézis a gélközegben történő elektroforézis és az immunodiffúzió kombinálása. Hatékony módszer a komplex antigénkeverékek szétválasztására. Technikai leírása és alkalmazhatósága a növényi virológiában Hampton et al. (1990) munkájában részletesen szerepel. Az immunoelektroforézis egyik változata az ún. rocket immunoelektroforézis (Tóbiás et al., 1979; Laurell és McKay, 1981), amelyben az antigén az antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Ha a két reagens találkozik, a precipitációs ív egy rakéta, ill. egy kúpszerű alakzat körvonalaihoz hasonló, a körülhatárolt terület nagysága pedig az antigén koncentrációjával arányos. A módszer 1 mg levélszövetben jelenlévő 1 ng – 0,4 µg mennyiségű vírus kimutatására alkalmas (Hagen et al., 1982).
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) meghatározása rocket immunoelektroforézissel (Tóbiás et al., 1979; Burgyán és Gáborjányi, 1984)
Az agarózoldat elkészítése. (Egy 9x12 cm-es nagyságú lemez 15 ml 0,75%-os agarózt tartalmazzon 0,02 M-os veronál-pufferben (pH 8,6) és 0,1%-os Na azidban.)
Ha az agaróz 50–55 °C-ra lehűlt, akkor 2 cm2 agarózhoz 1 µl antiszérumot adunk.
Az agarózlemezre lyukakat vágunk, a növényi mintát ezekbe csepegtetjük.
A lemezt 24 óráig 4 °C-on, vagy szobahőmérsékleten, vízhűtés mellett, 50 V feszültség alá helyezzük (2 V/cm).
A lemezt – általában szűrőpapíros felitatással – megszárítjuk.
A megszárított lemezhez annyi foszfát-puffert adunk (pH: 7,0), hogy azt befedje, majd két óráig a pufferben, egy óráig pedig desztillált vízben áztatjuk.
A lemezt „Comassie Brilliant Blue G-250” nevű festékkel színezzük. Fél óráig történő rázatás után a festéket eltávolítjuk, majd 10 percig újraszínezünk. Ezt követően desztillált vizes áztatás, majd a lemez szárítása következik.
Kalibrációs görbék segítségével a precipitációs csúcsok magasságából következtetni lehet a vírus koncentrációjára.
Az „ELISA” mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először növényvírusok kimutatására.
Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és Bar-Joseph, 1984). Direkt és indirekt ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle változat lehetséges (82A–F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását, ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy „kettősszendvics-módszer”) igen specifikus, pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem az antitesthez kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal szemben.
82. ábra - A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum [Hampton et al., 1990 után]
Direkt ELISA
Kettősellenanyag-szendvics (DAS ELISA) (Clark és Adams, 1977)
A növényvirológiában a leggyakrabban az ún. duplaellenanyag-szendvics (double antibody sandwich) módszert alkalmazzák (DAS ELISA) a fertőzések kimutatására. A vizsgálatokhoz ún. mikrotitráló lapokat használunk, amelyek polisztirolból készülnek, és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel (mintahely) rendelkeznek.
Először az IgG oldatot pipettázzuk a cellákba. Az inkubálás során az IgG molekulák a poliszirolhoz kötődnek, ezáltal a lap mélyedéseinek felszíne IgG molekulákkal lesz kibélelve. A nem kötődött IgG molekulákat mosópufferrel eltávolítjuk. Ezután a cellákba a növényi minták szövetnedvei kerülnek. Amennyiben a minta tartalmazta azt az antigént (vírust), amely ellen a kötődött IgG is készült, akkor a vírus a lemezhez kötött IgG-hez kapcsolódik, míg a növényi fehérjék és más vírusok nem. Inkubálás után a nem kötődött anyagok a cellákból pufferrel kimoshatók. Ezután pipettázzuk a cellákba a második, enzimmel jelzett IgG-t, azaz a konjugátumot. Ha a vírus jelen van (az immobilizált IgG-hez kapcsolódva) a cellában, akkor az enzimmel jelzett IgG (konjugátum) a vírus másik feléhez kötődik. Ezáltal létrejön az „immunszendvics”. A nem kötődött konjugátumot pufferes mosással eltávolítjuk, majd az enzim szubsztrátjának oldata kerül a cellákba. A leggyakrabban alkalmazott enzim, az alkalikus foszfatáz esetében a szubsztrát para-nitro-fenil-foszfát, amely színtelen vegyület. Az alkalikus foszfatáz enzim a szubsztrátmolekulákról elkezdi hasítani a foszfátcsoportokat, amelynek eredményeként sárga színű para-nitro-fenol keletkezik. A színváltozás erőssége közvetve a vírus koncentrációjával arányos. Az enzim addig működik, amíg megfelelő kémiai környezet és szubsztrát jelen van. A pozitív reakció szemmel is jól látható, de általában ELISA-értékelő fotométerrel (ELISA reader) értékelik az eredményeket (82A ábra).
Direkt eljárás
Az antigén kötődik először a mikrotitráló lemez falához (82E ábra). Ebben az esetben az antigén kötődik először a cella falához, majd megfelelő mosás után az antitest és az enzim konjugátumát, végül pedig az enzim szubsztrátumát adjuk a cellába, ahogyan az a DAS ELISA eljárásnál is történik.
Direkt biotin-avidin ELISA
A szokványos ELISA-teszttel szemben, ahol az antitesthez kapcsolják az enzimet, a biotin-avidin rendszer növeli a reakciók érzékenységét és szélesebb körű szerológiai rokoni kapcsolatok feltárását teszi lehetővé. Viszonylag régóta ismert, hogy a tojásfehérjében található egy avidinnek nevezett fehérje, amely a biotinhez (H-vitamin, koenzim R) kapcsolódva megakadályozza a biotinnek a belekből történő felszívódását. Később a Streptomyces avidini baktérium egyik fehérjéjéről is hasonló tulajdonságot mutattak ki. E fehérjét sztreptavidinnek nevezik. Mindkét anyag alkalmas a diagnosztikai felhasználásra. A sztreptavidin fizikai tulajdonságai azonban jobbak, ezért ennek a felhasználása terjed. A módszer alapváltozatában az IgG-t biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. Az antitesthez kapcsolt biotin az antitest aktivitását kevésbé csökkenti, mint az enzim. Az eljárás röviden a következő:
A cella falát először IgG-vel érzékenyítjük.
Mosás után a mintát hozzáadjuk.
Ezután biotinnal kapcsolt antitesttel inkubálunk.
Mosás után avidin (sztreptavidin)–enzim konjugátum hozzáadása következik.
Végül az enzim szubsztrátjának a bevitele történik.
A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kimutatása DAS ELISA módszerrel
Az eljáráshoz szükséges a vírus kimutatására alkalmas ELISA kit (Boehringer, Sanofi, Loewe), amely tartalmazza az antiszérumot és az antiszérum–enzim konjugátumot, valamint a pozitív és negatív növényi kontrollmintákat.
A lemez IgG-vel történő érzékenyítése: Az antiszérumot fedőpufferrel 500-szorosára hígítjuk. Az oldatból 200-200 μl-t pipettázunk a cellákba, és négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő eltelte után mosópufferrel kétszer kimossuk a cellákat, majd ismételten kétszer, de ekkor a puffert 3-3 percig a cellákban hagyjuk.
A növényi minták felvitele: 0,4 g friss súlyú növényi mintát 2 ml homogenálópufferben eldörzsölünk, majd a felülúszót leöntjük és Eppendorf-csőben 12 000 fordulatszámon (rpm) kb. 5 percig centrifugáljuk. Nagyszámú minta esetén növényi homogenizálóberendezések is alkalmazhatók. Nemcsak a vizsgálandó növényi mintákat, hanem pozitív és negatív kontrollmintákat is fel kell vinni a cellákba. A cellákba pipettázott növényi mintákat egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután kétszer mosópufferrel mossuk a cellákat, majd ismételten háromszor, a mosópuffer három percig cellákban történő inkubálásával.
Az IgG-enzim (alkalikus foszfatáz) konjugátumot konjugátumpufferben 500-szorosára hígítjuk, majd a cellákba pipettázzuk. A konjugátumot 4 órán át 35 °C-on inkubáljuk a cellákban, majd elvégezzük a mosást a b pont szerint.
A szubsztrát (4-nitrofenil-foszfát) hozzáadása. A szubsztrát elkészítése: Folyamatos keverés mellett 4-nitrofenil-foszfátot szubsztrátpufferben 1:1 arányban feloldunk. 150–150 μl-t a cellákba pipettázunk. 35 °C-on kb. 30 percig inkubálunk.
A reakciót 50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk (nem szükségszerű).
A színváltozás mértékét ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük. Ha a minták abszorbciós értékei a negatív kontroll abszorbciós értékének a kétszeresét meghaladják, akkor tekinthető a vizsgált minta az adott vírusra nézve pozitívnak.
A szükséges pufferek összetétele:
Fedő (coating) puffer: 1,59 g Na2CO3; 2,93 g NaHCO3; 0,2 g NaN3 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,6).
PBS–Tween mosópuffer: 0,5 ml Tween-20 feloldása 1 liter-PBS oldatban, keverés mellett.
10 × PBS-oldat (phosphate-buffer saline) (10-szeres töménységben, ezért közvetle-nül a felhasználás előtt 10-szeres hígítást kell készíteni): 72 g NaCl; 4,3 g KH2PO4; 14,4 g Na2HPO4 × 2 H2O (vagy: 29 g Na2HPO2 × 12 H2O); 1g Merthiolát (Thimerosal) 1liter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 7,4).
Kivonó (homogenáló) puffer: IgG puffer + 2% polivinil-pirrolidon (PVP).
IgG puffer: 1% BSA-t (marhabovin-szérumalbumin) vagy sovány tejport tartalmazó PBS–Tween-oldat, melyet a tejpor szuszpendáltatása után több réteg szűrőpapíron át kell szűrni.
Konjugátumpuffer: ugyanaz, mint a kivonó puffer.
Alkalikus foszfatáz szubsztrátpuffer: 97 ml diethanol-amin; 0,2 g MgCl2 × 6 H2O; 0,2 g NaN3 1 1iter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,8; 1 N HCl-lel beállítva).
Indirekt ELISA
Indirekt F(ab’)2 ELISA (Barbara és Clark, 1982)
Az első lépésben csak a specifikus IgG F(ab’)2 fragmentuma kapcsolódik a lemezhez. Pufferes mosás után a minta becsepegtetése és az antigén megkötődése következik. Ezt követően ismét mosás következik, majd a következő műveletben a teljes IgG-t mérik be, amely az immobilizált antigénhez (vírushoz) kötődik. Ez az IgG nincs enzimmel jelölve. A protein A-nak nevezett sejtfalfehérje – amelyet a Staphylococcus aureus nevű baktérium termel – jellemző tulajdonsága az, hogy kötődik az IgG molekulák nem antigénspsecifikus F(c) régiójához. Ezt a protein A-t ugyanúgy lehet enzimmel jelölni, mint az IgG molekulákat. Ha az indirekt ELISA utolsó előtti lépésekor ilyen enzimmel konjugált protein A-t pipettázunk a lyukakba, akkor az csak a teljes IgG molekulákhoz kapcsolódik, az antigén hiányában esetleg „csupaszon” maradt F(ab’)2 fragmentumokhoz nem. Az utolsó lépés ebben az esetben is az enzim szubsztrátjának a bevitele. E változatnál nem kell minden vírus ellen termeltetett IgG-t külön-külön enzimmel konjugálni, elég a protein A-enzim konjugátum használata. Az indirekt módszer elnevezés arra utal, hogy az enzim nem közvetlenül a specifikus IgG-hez van kapcsolva (82B ábra).
Indirekt DAS ELISA (van Regenmortel és Burckard, 1980)
E vizsgálatban először a vírus ellen egy állatfajban (1. állat) termeltetett IgG-vel érzékenyítjük a lemezt. Ezután becsöpögtetjük a növényi mintát. A megfelelő inkubálás és mosások után egy másik állatfajban (2. állat) ugyanarra a vírusra specifikusan termeltetett IgG kerül a lyukakba. Ezután a 2. állat IgG-je ellen termelt 3. állat IgG-enzim konjugátuma következik. Végül pedig az enzim szubsztrátja kerül a cellába (82C ábra).
Indirekt ELISA (Lommel et al., 1982)
Először az antigént kötjük a lemez falához, majd az IgG-t. Ezt követi az első állatfaj IgG-je ellen egy másik állatfajban termeltetett IgG-enzim konjugátuma, majd a szubsztrátum hozzáadása (82F ábra).
Módosított F(ab’)2 vagy protein A ELISA
Ennél a változatnál a protein A fehérjét kétszer kell bevinni a cellába (Edwards és Cooper, 1985). Először a protein A réteget a cella falához kötjük, amihez a továbbiakban az antitest kötődik. A vírussal és a második antitestréteggel történő inkubáció után enzimmel konjugált protein A-t adunk a második réteg antitest-detektálása céljából. E módszer legfőbb előnye, hogy csak egyféle antiszérum szükséges hozzá, mivel az enzimet nem az antitesthez, hanem a protein A-hoz kapcsoljuk (82D ábra).
A protein A ELISA-eljárás
Általában 1 µg protein A-t 1 ml fedőpufferben feloldva 200 µl protein A-oldattal érzékenyítjük a lemezt, majd kb. négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő letelte után kétszer desztillált vízzel, majd egyszer PBS–Tween mosópufferrel történő mosás szükséges.
200–200 μl specifikus IgG antiszérum felvitele az antiszérum titerértékétől függő, de általában 500–1000-szeres hígításban történik. Négy óráig 35 °C-on történő inkubáció, majd mosás az a lépés szerint.
Növényi minták felvitele: 0,4 g friss levél 2 ml kivonópufferben történő homogenálása, majd a felülúszó Eppendorf-csőben történő centrifugálása 5 percig, vagy a homogenátum vattán történő átszűrése. Inkubálás 4 °C-on egy éjszakán át, majd háromszori desztillált vízzel történő mosás, és kétszeri PBS–Tween mosópufferrel történő mosás következik. Kiöntés előtt a puffert 3 percig hagyjuk a cellákban.
A második IgG réteg felvitele [lásd b lépés].
Protein A-enzim konjugátum felvitele. Előtte a konjugátumot ún. konjugátumpufferrel – a konjugátum minőségétől függően – hígítjuk (pl. 20 ml pufferben 5 µl konjugátumot oldunk). Ezután a lépés után az inkubáció 4 órán keresztül 35 °C-on történik, majd a c lépés szerinti mosás következik.
A szubsztrátum felvitele. Ha az enzim alkalikus foszfatáz, akkor a szubsztrát 4-nitrofenil-foszfát. Ha az enzim peroxidáz, akkor a szubsztrát o-fenilén-diamin lesz.
A szubsztrát felvitele után a reakcióelegyet 35 °C-on inkubáljuk. A pozitív minták esetében rövid idő alatt kialakul a narancssárga színreakció.
Ha az enzim alkalikus foszfatáz volt, a reakciót cellánként 50-50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk.
A lemezt ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük.
O-fenilén-diamin (OPD) készítése:
1 kapszula OPD-t 50 ml citromsavas foszfátpufferben feloldunk. Az OPD erősen rákkeltő hatású, ezért gumikesztyű használata kötelező. Az OPD fényérzékeny, ezért feloldásakor a főzőpoharat alufóliába kell csomagolni és a bemérés után a lemezt is takarni kell.
50 ml bidesztillált vízben 1 tabletta Hyperolt oldunk fel. H2O2 keletkezik.
A hidrogén-peroxid (H2O2) oldatból 500 μl-t adunk az 50 ml OPD-oldathoz, és kevertetjük. Az így nyert elegyből 150 l mennyiséget pipettázunk a lemez celláiba.
Citromsavas foszfátpuffer készítése:
5,6 g citromsav; 11,2 g Na2HPO4 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 5).
A reakcióhoz szükséges egyéb pufferek (fedő-, azaz coating), PBS–Tween mosópuffer, IgG-puffer, kivonópuffer, konjugátumpuffer – mely ugyanaz, mint az IgG-puffer – elkészítésének módja az előző fejezetben található.
A radioimmuno-tesztek során az antitestet nem enzimhez kötik, hanem radioaktív izotóppal jelölik. A költséges számlálószerkezet, valamint a rádioaktív anyagok használata miatt ezt az eljárást a növényi virológiában csak ritkán alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).
Ezen eljárások az ELISA érzékenységét fokozó, annak továbbfejlesztett változatai. Az immunoblotting eljárásokról nemrégiben kiváló tanulmányok születtek, és alkalmazásuk a növényi virológia területén Koenig és Burgermeister (1986), Hampton et al. (1990) munkáiban részletesen leírásra kerültek. Az immunoblotting diagnosztika három részterületet ölel fel. Ezek a következők: Western blot technika, dot-blot immunteszt (DIA) és a szöveti (tissue) blotting.
A Western blot technika
Ezen eljárás első lépéseként a gélben lévő proteineket először elektroforézissel szétválasztják. Ezután a fehérjék a gélből egy membránra kerülnek, amihez az antitesteket kötik. A proteinek a gélből a legegyszerűbben passzív úton kerülnek a membrán felületére. A nagyobb molekulatömegű fehérjék esetében azonban hatékonyabb az ún. elektroblot immunteszt alkalmazása. Az eljárást Tobwin et al. (1979) fejlesztették ki, melynek lényege röviden a következő: a gélben lévő proteineket először itt is elektroforézissel választják szét. A gél egyik oldalán szűrőpapír, a másik oldalán pedig membrán és szűrőpapír van. Ezt a „szendvicset” elektromos áram alá helyezik, melynek hatására a térerősségtől és a gél vastagságától függően 1–12 óra alatt a fehérjék a szűrőre kerülnek. A termelődött hő elvezetéséről gondoskodni kell. Az újabban elterjedt, ún. „félszáraz” blottolási technika esetében kevesebb mennyiségű puffer felhasználására van lehetőség. A fehérjék membránra történő átjutási ideje nagyon rövid, 0,5–0,75 mm gélvastagság esetén mintegy 30 perc.
Dot-blot immunteszt
Banttari és Goodwin (1985) nyolcszoros érzékenységnövekedést ért el azzal, hogy az ELISA-eljáráshoz nem polisztirol lapot, hanem nitrocellulóz membránt használt. A membránt apró korongokra darabolva, vagy műanyag sablonba szorított nagyobb membránszelet formájában használják. Utóbbi esetben a sablonból kivett membránon színes foltok (dot) formájában láthatók a pozitív reakciók.
A dot-blot technika esetén a tisztított antigént vagy a szövetnedvet közvetlenül a nitrocellulóz membránhoz kötik, a műveletet megelőző elektroforetikus szétválasztás nélkül (Banttari és Goodwin, 1985; Hibi és Saito, 1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A BSA-val (bovin-szérumalbumin) történő telítés után a blottokat sorrendben antitesttel, IgG-enzim konjugátummal, majd a szubsztrátummal inkubálják, mint a Western blot teszt során. A technika monoklón és poliklón antitestek esetén is alkalmazható (Rocha-Pena et al., 1991). Ezzel az eljárással az alkalmazandó reagensek kis mennyisége miatt fél pikogram-mennyiségű vírus is kimutatható.
A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatása dot-blot technikával (Moya et al., 1997)
Növényi minta előkészítése. Egy gramm levelet 40 ml Tris-HCl-ben homogenálunk (pH 6,8), amely 30 mM aszkorbinsavat és 0,2% 2-merkaptoetanolt tartalmaz. A keveréket öt percig 100 °C-on történő felmelegítéssel denaturáljuk.
A nitrocellulóz membránt óvatosan a TBS-puffer felszínére helyezve megnedvesítjük.
A membránt öt percig szűrőpapíron szárítjuk (ma már olyan membránok is léteznek, melyek használatánál a b és a c művelet elvégzése nem szükséges).
1 μl növényi mintát csepegtetünk a membránra, majd azt 5 percig szűrőpapíron szárítjuk.
A filtert blokkoló oldatban (5% sovány tejport tartalmazó PBS-oldat) egy órán keresztül rázatjuk, majd egy pillanatra desztillált vízbe mártjuk.
Monoklón antitesttel kezeljük a szűrőt (0,1 g/ml PBS-oldatban).
Ezután desztillált vízbe történő bemártás, 2 × 10 percig TTBS-oldatban történő mosás, majd ismételten egy pillanatra desztillált vízbe történő bemártás következik.
A szűrőt peroxidázzal jelzett „antiegér“ antiszérumban inkubáljuk.
Desztillált vizes bemártás, majd 10 percig TTBS-ben, és 10 percig TBS-ben történő gyenge rázatás következik.
A membránt öt percig az előhívó oldatban előhívjuk.
Desztillált vizes öblítés után az értékelés következik.
TBS-puffer: 0,02M-os Tris-HCl; 0,5M-os NaCl (pH 7,5).
TTBS-puffer: 0,05%-os Tween 20 TBS pufferben.
Előhívó oldat: 6 ml dimetil-szulfoxid; 0,1 g 3 amino-9 etil-karbazol; 50 ml 0,02 M-os
nátrium-acetát-puffer (pH 5,1); 0,4 ml hidrogén-peroxid. Frissen készítendő!
Szöveti (tissue) blotting
Ez az eljárás a dot-blothoz hasonló, de nincsen szükség a növényi minta homogenálására. A friss növénymintát egyszerűen rányomjuk a nitrocellulóz membránra, majd a dot-blot eljárás szerint „előhívjuk” (Lin et al., 1990).