Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A szerológiai reakciók alaptípusai

A szerológiai reakciók alaptípusai

Precipitáció

Az elnevezés onnan származik, hogy ha megfelelő mennyiségű antigén és antitest találkozik egymással, akkor a reakció látható csapadékképződésben nyilvánul meg. A növényi minta szövetnedvét összekeverjük az antiszérummal. Az inkubálás után szabad szemmel vagy mikroszkóppal értékelünk. Amennyiben az antigén (azaz a keresett vírus) jelen volt a szövetnedvben, akkor az antigén–antitest reakció következtében apró pelyhekből álló csapadék keletkezik. A precipitációs tesztek a legrégebben alkalmazott eljárások az antigén–antitest kölcsönhatások tanulmányozására (Heidelberger és Kendall, 1935; Kleczkowski, 1966). A precipitáció és az agglutináció elkülönítése a reagáló antigén mérete alapján történik. A precipitáció a makromolekulák és a vírusrészecskék oldhatatlanságára utal, míg az agglutináció a sejtek, ill. a hozzá hasonló méretű részecskék összetömörülését jelenti.

Folyékony közegben történő precipitációs teszt

  1. Az antiszérumból megfelelő pufferrel hígítási sorozatot készítünk.

  2. 0,5 ml antiszérumot ugyanannyi mennyiségű növényi szövetnedvvel kémcsőben összekeverünk és vízfürdőben 25–40 °C-on inkubálunk.

  3. Az a legmagasabb hígítási érték, amelynél az antiszérum a neki megfelelő, ismert koncentrációjú antigénnel reagálva még látható precipitációt mutat, az antiszérum titerértékeként ismert és az inkubálás után egy, ill. két órával meghatározható. A precipitációt láthatóbbá lehet tenni, ha a kémcsövet fekete hátterű fényforrás elé helyezzük.

A precipitációs tesztek eredményességét számos tényező befolyásolja. Fontos tényező az antigén mérete. A fonál alakú, 500–1000 nm hosszúságú vírusrészecskék már kisebb mennyiségű antitesttel is jól látható precipitációt eredményeznek, mint a kisebb (izometrikus) virionok vagy a disszociált fehérjealegységek (Van Slogteren és Dubs, 1993). A titerérték általában 10–3, ill. 10–4 a fonál alakú vírusoknál, míg a disszociált vírusalegységeknél ritkán magasabb, mint 10–2.

Az antigén–antitest reakció kémcső helyett lejátszódhat tárgylemezen, vagy Petri-csészében is (Wetter, 1965; Noordam, 1973; Dijkstra és De Jager, 1998). Ezek az ún. mikroprecipitációs tesztek. Tárgylemez használata esetén az üvegfelületet hidrofóbbá kell tenni szilikonnal vagy 0,1%-os formvarral. Ha a reakció Petri-csészében történik, akkor az evaporáció elkerülése végett ásványi olajat kell rétegezni a felületre. A lemezeket nedves kamrában kell tartani. A csapadékképződést szobahőmérsékleten 0,5–1 órás inkubálás után mikroszkóppal lehet megfigyelni. 4 °C-on hosszabb, mintegy 6 órás inkubációs idő szükséges. A mikroprecipitáció cseppben történő lejátszódásának fő előnye a reagensek gazdaságos felhasználása.

A precipitációs tesztek másik altípusa az, mikor az antiszérum 10–30%-os glicerines sóoldatban hígítva egy kis kémcső aljára kerül, amire úgy rétegzik rá az antigént, hogy a kettő között éles határfelület képződjön. Pozitív reakció esetén a határfelületen precipitációs gyűrű alakul ki. E módszer előnye, hogy a reagensek koncentrációja kevéssé kritikus. Többféle vírus kimutatására sikeresen alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

A precipitációs teszteket vagy tisztított víruspreparátummal végzik, vagy a fertőzött növény leszűrt szövetnedvével. Ha a vírus a gazdanövényében csak nagyon kis koncentrációban van jelen, akkor szükséges a növényi szövetnedvet ultracentrifugálással koncentrálni.

A folyadékprecipitációs tesztek fő alkalmazási területe az antiszérum-titerérték segítségével a vírusok jellemzése és a nagyméretű, immundiffúziós tesztekkel nem tanulmányozható vírusok közötti szerológiai rokonság felderítése. Két vírus közötti rokonsági kapcsolat kimutatására jól használható az ún. szerológiai differenciálindex (SDI).

Agglutináció

Az agglutinációs reakciókban az antigént vagy az antitestet a vörösvérsejtek vagy egyéb hordozórészecskék, pl. latex szemcsék felületére kötik. Ebben az esetben a sejtek és a latex partikulák mérete miatt látható szerológiai reakció képződik még akkor is, ha a reagensek alacsony koncentrációja a látható precipitációt nem tenné lehetővé. A passzív hemagglutináció esetében a vírusrészecskék vagy az antitestek a vörösvérsejtekhez különböző kémiai kezelések által kötődnek (Rajeshwari et al., 1981; van Regenmortel, 1982), míg a latex tesztnél az antitest egyszerű adszorpcióval kötődik a latex partikulákhoz. Ezért a vírussal (antigénnel) történő pozitív reakció esetén a latex szemcsével megnövelt antitest és a vírusrészecskék aggregálódása következtében a precipitáció láthatósága megnövekszik. Az antitest-molekulák a latex szemcsékhez egy ún. protein A közbülső réteggel is kapcsolódhatnak (Torrance, 1980). Az agglutinációs tesztek érzékenysége 2–3-szor nagyobb, mint a precipitációs vagy az immunodiffúziós teszteké (van Regenmortel, 1982). A zselatinból és különböző színű gumiarábikumból készült, 3 μm átmérőjű zselatinszemcsék szintén sikerrel alkalmazhatók a növényi vírusok kimutatásában.

Immunodiffúziós tesztek

Az immunodiffúziós tesztek gélben lejátszódó precipitációs tesztek. Két fő változatuk ismert.

Az egyszerű géldiffúzió esetében az antigén diffundál abba a közegbe, amely az antitestet tartalmazza. Az immunodiffúziós teszteknek a növényi virológiában leggyakrabban használt változata a kettős (dupla) géldiffúzió, amelyben mind az antigén, mind pedig az antitest gélközegbe vágott különálló lyukakban helyezkedik el és egymás felé diffundál (Shepard, 1972). Az immuno-elektronmikroszkópos módszer az immunodiffúziós teszteket és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat együtt tartalmazza. Ezt a módszert részletesen az Immuno-elektronmikroszkópos módszer c. fejezet tárgyalja.

Egyszerű géldiffúzió

A reakció kb. 1 cm-es átmérőjű és 7–8 cm hosszú kémcsőben zajlik le. A kémcső aljára kerül az antiszérummal kevert agar vagy agaróz (szilárd fázis), rárétegezve pedig az antigén folyékony fázisban. A precipitációs gyűrű a kémcső alja felé mozdul el. A mozgás sebessége az antigén diffúziós állandójától, valamint az antigén és az antitest koncentrációjától függ. A többszörös zónák kialakulása különböző antigén-komponensek jelenlétére utal (Oudin, 1952).

Radiál géldiffúzió

Az egyszerű diffúzió másik változata a sugárirányú, ún. radiális géldiffúzió (Vaerman, 1981), ahol az antigén egy központi lyukban helyezkedik el, és az azt körülvevő, antitestet tartalmazó agargélbe diffundál. A lyuk körüli precipitációs gyűrű vastagsága az antigén koncentrációjával arányos.

Kettős géldiffúzió

Az immunodiffúziós tesztek közül a növényvirológiában leggyakrabban az Ouchterlony-féle (1968) kettős diffúziós módszert alkalmazzák. Ennek az a lényege, hogy vékony agarlemezbe lyukakat vágunk úgy, hogy egy középső lyukat 6–8 másik lyuk vegyen körül. A középső lyukba antiszérumot cseppentünk, míg a szélsőkbe a vizsgálandó növényi minták szövetnedvei kerülnek. Az antitestek és az antigének is diffundálnak az agarban. Ahol találkoznak, ott az agarban félhold alakú precipitációs ív keletkezik. A módszer izometrikus és pálcika alakú vírusokra alkalmazható. A hosszú, fonál alakú vírusokat előbb olyan kezelésnek kell alávetni, amely biztosítja a köpenyfehérjék szabad diffúzióját. Miután a reagensek a lyukakba kerültek, az antigén diffúziós együtthatójától függően a diffúzió 24–72 óráig tart. A párolgás gátlása céljából a Petri-csészét nedves kamrában tartjuk, vagy a gél tetejére könnyű ásványi olajréteget helyezünk. A precipitációs ívek a Petri-csészét megvilágítva sötét háttér előtt tisztán látszódnak.

Precipitációs minták

Ha a lyukakban a reagensek megfelelő arányban vannak, akkor a precipitációs ív helyzete és görbülete utal az antigén méretére. Ha az antigén diffúziós koefficiense ugyanakkora, mint az antitestté (5 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív egyenes lesz, és egyforma távolságra helyezkedik el a két lyuktól. Ha a vírusrészecskék diffúziós együtthatója alacsonyabb (0,3–1,6 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív az antigén lyukhoz közel helyezkedik el, és körbefogja azt (van Regenmortel, 1982). Ha két egymás mel-lett elhelyezkedő antigén diffundál ugyanazon antitestforrás felé, akkor a precipitációs ívek találkozásánál különböző minták alakulhatnak ki. Három alapváltozat lehetséges: 1. egybeolvadó (koaleszcens), 2. ívek kereszteződése és 3. sarkantyúképzés (spur), amelyek a két vírus közötti rokonsági kapcsolat meghatározására jól használhatók. Ha a precipitációs ívek összeérnek (koaleszcens minta), akkor a két egymás melletti lyukban elhelyezkedő vírus szerológiailag azonos. Ha a két precipitációs ív keresztezi egymást, a két vírus nincs egymással rokonsági kapcsolatban. A sarkantyú- vagy spurképződés arra utal, hogy a két összehasonlítandó vírus azonos, de különböző epitópokat is tartalmaz (81. ábra).

81. ábra - A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990 után]

A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990 után]


Az Ouchterlony-technika alkalmazása Na-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében

A fonál alakú vírusok hosszúságuknak és aggregálódó képességüknek megfelelően a 0,5–1,0%-os agargélben nem diffundálnak. Ahhoz, hogy a gélben történő diffúziót lehetővé tegyük, a részecskéket ultrahanggal össze kell törni, vagy kémiai úton, alkáli pufferrel, detergensekkel, pirrolidinnel vagy nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kell szétbontani (Purcifull és Batchelor, 1977). Az SDS-t vagy a gélbe keverik, vagy összekeverik az antigénnel, hogy megkönnyítsék a disszociációt. Az eljárást Gooding és Bing (1970) dolgozta ki a hosszú, fonál alakú vírusokra, de ma már más morfológiájú vírusokra, valamint fehérje-zárványtestek detektálására is alkalmazható.

A disszociált köpenyfehérje-alegységek már könnyen diffundálnak, és így lehetővé válik bármely méretű vírus esetében az immunodiffúziós tesztek alkalmazása. A különböző vírusok disszociált alegységei szerológiailag szorosabb rokonságot mutatnak, mint az intakt vírusok, ezért ezzel a megközelítéssel a rokon vírusok vagy vírustörzsek között további keresztreakciókat lehet kimutatni (Shepard et al., 1974; Dijkstra és De Jager, 1998).

A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) meghatározása Ouchterlony-módszerrel SDS jelenlétében (Purcifull és Batchelor, 1977)

  1. Az agar előkészítése: A közeg 0,8% agart, 1% NaN3-t és 0,5% SDS-t tartalmaz. 4 g agarhoz 300 ml desztillált vizet adunk és 5 perc alatt 100 °C-on felolvasztjuk. A felolvasztott agarhoz 5 g nátrium-azidot (NaN3) adunk és jól összekeverjük. 2,5 g SDS-t 100 ml forró desztillált vízben feloldunk, ezt hozzáadjuk az agaroldathoz. A keveréket 500 ml-ig forró desztillált vízzel kiegészítjük és összekeverjük. 11 cm átmérőjű Petri-csészébe 12–12 ml oldatot öntünk. Miután az agar megszilárdult, a Petri-csészéket 4 °C-on nedves kamrában tároljuk.

  2. Az antigén előkészítése: A fertőzött és az egészséges növény levelét desztillált vízzel 1:1 arányban homogenáljuk, majd minden gramm levélszövethez 1 ml 3%-os SDS-t adunk. A mintát gézen átszűrjük.

  3. Az antiszérum előkészítése: A potyvirusok esetében az SDS-sel nem kezelt vírussal történő immunizálás is jó eredményt ad. Az antiszérumot általában nem hígítjuk, de ha mégis szükséges, akkor vagy a PBS-pufferrel, vagy 0,05 M Tris-HCl-lel (pH:7,2), amely 0,85% NaCl-ot és 5% bovin-szérumalbumint is tartalmaz.

  4. Az agarba lyukvágóval 7 mm átmérőjű lyukakat vágunk. Egy centrális lyuk körül 6 db perifériális lyuk legyen egymástól 4–5 mm-re. A középső lyukba az antiszérum, a szélsőkbe pedig a növényi minták kerülnek.

  5. Az inkubálás 24 °C-on történik, és az eredményeket 24–48 óra múlva feljegyezzük. A nem specifikus, nem antigén–antitest reakció következtében létrejövő precipitációs ívek kialakulása elkerülhető, ha a gélközeghez bovin-szérumalbumint is adunk.

Immunoelektroforézis

Az immunoelektroforézis a gélközegben történő elektroforézis és az immunodiffúzió kombinálása. Hatékony módszer a komplex antigénkeverékek szétválasztására. Technikai leírása és alkalmazhatósága a növényi virológiában Hampton et al. (1990) munkájában részletesen szerepel. Az immunoelektroforézis egyik változata az ún. rocket immunoelektroforézis (Tóbiás et al., 1979; Laurell és McKay, 1981), amelyben az antigén az antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Ha a két reagens találkozik, a precipitációs ív egy rakéta, ill. egy kúpszerű alakzat körvonalaihoz hasonló, a körülhatárolt terület nagysága pedig az antigén koncentrációjával arányos. A módszer 1 mg levélszövetben jelenlévő 1 ng – 0,4 µg mennyiségű vírus kimutatására alkalmas (Hagen et al., 1982).

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) meghatározása rocket immunoelektroforézissel (Tóbiás et al., 1979; Burgyán és Gáborjányi, 1984)

  1. Az agarózoldat elkészítése. (Egy 9x12 cm-es nagyságú lemez 15 ml 0,75%-os agarózt tartalmazzon 0,02 M-os veronál-pufferben (pH 8,6) és 0,1%-os Na azidban.)

  2. Ha az agaróz 50–55 °C-ra lehűlt, akkor 2 cm2 agarózhoz 1 µl antiszérumot adunk.

  3. Az agarózlemezre lyukakat vágunk, a növényi mintát ezekbe csepegtetjük.

  4. A lemezt 24 óráig 4 °C-on, vagy szobahőmérsékleten, vízhűtés mellett, 50 V feszültség alá helyezzük (2 V/cm).

  5. A lemezt – általában szűrőpapíros felitatással – megszárítjuk.

  6. A megszárított lemezhez annyi foszfát-puffert adunk (pH: 7,0), hogy azt befedje, majd két óráig a pufferben, egy óráig pedig desztillált vízben áztatjuk.

  7. A lemezt „Comassie Brilliant Blue G-250” nevű festékkel színezzük. Fél óráig történő rázatás után a festéket eltávolítjuk, majd 10 percig újraszínezünk. Ezt követően desztillált vizes áztatás, majd a lemez szárítása következik.

  8. Kalibrációs görbék segítségével a precipitációs csúcsok magasságából következtetni lehet a vírus koncentrációjára.

ELISA-módszerek

Az „ELISA” mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először növényvírusok kimutatására.

Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és Bar-Joseph, 1984). Direkt és indirekt ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle változat lehetséges (82A–F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását, ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy „kettősszendvics-módszer”) igen specifikus, pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem az antitesthez kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal szemben.

82. ábra - A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum [Hampton et al., 1990 után]

A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum [Hampton et al., 1990 után]


Direkt ELISA

  • Kettősellenanyag-szendvics (DAS ELISA) (Clark és Adams, 1977)

A növényvirológiában a leggyakrabban az ún. duplaellenanyag-szendvics (double antibody sandwich) módszert alkalmazzák (DAS ELISA) a fertőzések kimutatására. A vizsgálatokhoz ún. mikrotitráló lapokat használunk, amelyek polisztirolból készülnek, és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel (mintahely) rendelkeznek.

Először az IgG oldatot pipettázzuk a cellákba. Az inkubálás során az IgG molekulák a poliszirolhoz kötődnek, ezáltal a lap mélyedéseinek felszíne IgG molekulákkal lesz kibélelve. A nem kötődött IgG molekulákat mosópufferrel eltávolítjuk. Ezután a cellákba a növényi minták szövetnedvei kerülnek. Amennyiben a minta tartalmazta azt az antigént (vírust), amely ellen a kötődött IgG is készült, akkor a vírus a lemezhez kötött IgG-hez kapcsolódik, míg a növényi fehérjék és más vírusok nem. Inkubálás után a nem kötődött anyagok a cellákból pufferrel kimoshatók. Ezután pipettázzuk a cellákba a második, enzimmel jelzett IgG-t, azaz a konjugátumot. Ha a vírus jelen van (az immobilizált IgG-hez kapcsolódva) a cellában, akkor az enzimmel jelzett IgG (konjugátum) a vírus másik feléhez kötődik. Ezáltal létrejön az „immunszendvics”. A nem kötődött konjugátumot pufferes mosással eltávolítjuk, majd az enzim szubsztrátjának oldata kerül a cellákba. A leggyakrabban alkalmazott enzim, az alkalikus foszfatáz esetében a szubsztrát para-nitro-fenil-foszfát, amely színtelen vegyület. Az alkalikus foszfatáz enzim a szubsztrátmolekulákról elkezdi hasítani a foszfátcsoportokat, amelynek eredményeként sárga színű para-nitro-fenol keletkezik. A színváltozás erőssége közvetve a vírus koncentrációjával arányos. Az enzim addig működik, amíg megfelelő kémiai környezet és szubsztrát jelen van. A pozitív reakció szemmel is jól látható, de általában ELISA-értékelő fotométerrel (ELISA reader) értékelik az eredményeket (82A ábra).

  • Direkt eljárás

Az antigén kötődik először a mikrotitráló lemez falához (82E ábra). Ebben az esetben az antigén kötődik először a cella falához, majd megfelelő mosás után az antitest és az enzim konjugátumát, végül pedig az enzim szubsztrátumát adjuk a cellába, ahogyan az a DAS ELISA eljárásnál is történik.

  • Direkt biotin-avidin ELISA

A szokványos ELISA-teszttel szemben, ahol az antitesthez kapcsolják az enzimet, a biotin-avidin rendszer növeli a reakciók érzékenységét és szélesebb körű szerológiai rokoni kapcsolatok feltárását teszi lehetővé. Viszonylag régóta ismert, hogy a tojásfehérjében található egy avidinnek nevezett fehérje, amely a biotinhez (H-vitamin, koenzim R) kapcsolódva megakadályozza a biotinnek a belekből történő felszívódását. Később a Streptomyces avidini baktérium egyik fehérjéjéről is hasonló tulajdonságot mutattak ki. E fehérjét sztreptavidinnek nevezik. Mindkét anyag alkalmas a diagnosztikai felhasználásra. A sztreptavidin fizikai tulajdonságai azonban jobbak, ezért ennek a felhasználása terjed. A módszer alapváltozatában az IgG-t biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. Az antitesthez kapcsolt biotin az antitest aktivitását kevésbé csökkenti, mint az enzim. Az eljárás röviden a következő:

  1. A cella falát először IgG-vel érzékenyítjük.

  2. Mosás után a mintát hozzáadjuk.

  3. Ezután biotinnal kapcsolt antitesttel inkubálunk.

  4. Mosás után avidin (sztreptavidin)–enzim konjugátum hozzáadása következik.

  5. Végül az enzim szubsztrátjának a bevitele történik.

    • A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kimutatása DAS ELISA módszerrel

Az eljáráshoz szükséges a vírus kimutatására alkalmas ELISA kit (Boehringer, Sanofi, Loewe), amely tartalmazza az antiszérumot és az antiszérum–enzim konjugátumot, valamint a pozitív és negatív növényi kontrollmintákat.

  1. A lemez IgG-vel történő érzékenyítése: Az antiszérumot fedőpufferrel 500-szorosára hígítjuk. Az oldatból 200-200 μl-t pipettázunk a cellákba, és négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő eltelte után mosópufferrel kétszer kimossuk a cellákat, majd ismételten kétszer, de ekkor a puffert 3-3 percig a cellákban hagyjuk.

  2. A növényi minták felvitele: 0,4 g friss súlyú növényi mintát 2 ml homogenálópufferben eldörzsölünk, majd a felülúszót leöntjük és Eppendorf-csőben 12 000 fordulatszámon (rpm) kb. 5 percig centrifugáljuk. Nagyszámú minta esetén növényi homogenizálóberendezések is alkalmazhatók. Nemcsak a vizsgálandó növényi mintákat, hanem pozitív és negatív kontrollmintákat is fel kell vinni a cellákba. A cellákba pipettázott növényi mintákat egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután kétszer mosópufferrel mossuk a cellákat, majd ismételten háromszor, a mosópuffer három percig cellákban történő inkubálásával.

  3. Az IgG-enzim (alkalikus foszfatáz) konjugátumot konjugátumpufferben 500-szorosára hígítjuk, majd a cellákba pipettázzuk. A konjugátumot 4 órán át 35 °C-on inkubáljuk a cellákban, majd elvégezzük a mosást a b pont szerint.

  4. A szubsztrát (4-nitrofenil-foszfát) hozzáadása. A szubsztrát elkészítése: Folyamatos keverés mellett 4-nitrofenil-foszfátot szubsztrátpufferben 1:1 arányban feloldunk. 150–150 μl-t a cellákba pipettázunk. 35 °C-on kb. 30 percig inkubálunk.

  5. A reakciót 50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk (nem szükségszerű).

  6. A színváltozás mértékét ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük. Ha a minták abszorbciós értékei a negatív kontroll abszorbciós értékének a kétszeresét meghaladják, akkor tekinthető a vizsgált minta az adott vírusra nézve pozitívnak.

    • A szükséges pufferek összetétele:

  7. Fedő (coating) puffer: 1,59 g Na2CO3; 2,93 g NaHCO3; 0,2 g NaN3 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,6).

  8. PBS–Tween mosópuffer: 0,5 ml Tween-20 feloldása 1 liter-PBS oldatban, keverés mellett.

  9. 10 × PBS-oldat (phosphate-buffer saline) (10-szeres töménységben, ezért közvetle-nül a felhasználás előtt 10-szeres hígítást kell készíteni): 72 g NaCl; 4,3 g KH2PO4; 14,4 g Na2HPO4 × 2 H2O (vagy: 29 g Na2HPO2 × 12 H2O); 1g Merthiolát (Thimerosal) 1liter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 7,4).

  10. Kivonó (homogenáló) puffer: IgG puffer + 2% polivinil-pirrolidon (PVP).

  11. IgG puffer: 1% BSA-t (marhabovin-szérumalbumin) vagy sovány tejport tartalmazó PBS–Tween-oldat, melyet a tejpor szuszpendáltatása után több réteg szűrőpapíron át kell szűrni.

  12. Konjugátumpuffer: ugyanaz, mint a kivonó puffer.

  13. Alkalikus foszfatáz szubsztrátpuffer: 97 ml diethanol-amin; 0,2 g MgCl2 × 6 H2O; 0,2 g NaN3 1 1iter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,8; 1 N HCl-lel beállítva).

Indirekt ELISA

  • Indirekt F(ab’)2 ELISA (Barbara és Clark, 1982)

Az első lépésben csak a specifikus IgG F(ab’)2 fragmentuma kapcsolódik a lemezhez. Pufferes mosás után a minta becsepegtetése és az antigén megkötődése következik. Ezt követően ismét mosás következik, majd a következő műveletben a teljes IgG-t mérik be, amely az immobilizált antigénhez (vírushoz) kötődik. Ez az IgG nincs enzimmel jelölve. A protein A-nak nevezett sejtfalfehérje – amelyet a Staphylococcus aureus nevű baktérium termel – jellemző tulajdonsága az, hogy kötődik az IgG molekulák nem antigénspsecifikus F(c) régiójához. Ezt a protein A-t ugyanúgy lehet enzimmel jelölni, mint az IgG molekulákat. Ha az indirekt ELISA utolsó előtti lépésekor ilyen enzimmel konjugált protein A-t pipettázunk a lyukakba, akkor az csak a teljes IgG molekulákhoz kapcsolódik, az antigén hiányában esetleg „csupaszon” maradt F(ab’)2 fragmentumokhoz nem. Az utolsó lépés ebben az esetben is az enzim szubsztrátjának a bevitele. E változatnál nem kell minden vírus ellen termeltetett IgG-t külön-külön enzimmel konjugálni, elég a protein A-enzim konjugátum használata. Az indirekt módszer elnevezés arra utal, hogy az enzim nem közvetlenül a specifikus IgG-hez van kapcsolva (82B ábra).

  • Indirekt DAS ELISA (van Regenmortel és Burckard, 1980)

E vizsgálatban először a vírus ellen egy állatfajban (1. állat) termeltetett IgG-vel érzékenyítjük a lemezt. Ezután becsöpögtetjük a növényi mintát. A megfelelő inkubálás és mosások után egy másik állatfajban (2. állat) ugyanarra a vírusra specifikusan termeltetett IgG kerül a lyukakba. Ezután a 2. állat IgG-je ellen termelt 3. állat IgG-enzim konjugátuma következik. Végül pedig az enzim szubsztrátja kerül a cellába (82C ábra).

  • Indirekt ELISA (Lommel et al., 1982)

Először az antigént kötjük a lemez falához, majd az IgG-t. Ezt követi az első állatfaj IgG-je ellen egy másik állatfajban termeltetett IgG-enzim konjugátuma, majd a szubsztrátum hozzáadása (82F ábra).

  • Módosított F(ab’)2 vagy protein A ELISA

Ennél a változatnál a protein A fehérjét kétszer kell bevinni a cellába (Edwards és Cooper, 1985). Először a protein A réteget a cella falához kötjük, amihez a továbbiakban az antitest kötődik. A vírussal és a második antitestréteggel történő inkubáció után enzimmel konjugált protein A-t adunk a második réteg antitest-detektálása céljából. E módszer legfőbb előnye, hogy csak egyféle antiszérum szükséges hozzá, mivel az enzimet nem az antitesthez, hanem a protein A-hoz kapcsoljuk (82D ábra).

  • A protein A ELISA-eljárás

  1. Általában 1 µg protein A-t 1 ml fedőpufferben feloldva 200 µl protein A-oldattal érzékenyítjük a lemezt, majd kb. négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő letelte után kétszer desztillált vízzel, majd egyszer PBS–Tween mosópufferrel történő mosás szükséges.

  2. 200–200 μl specifikus IgG antiszérum felvitele az antiszérum titerértékétől függő, de általában 500–1000-szeres hígításban történik. Négy óráig 35 °C-on történő inkubáció, majd mosás az a lépés szerint.

  3. Növényi minták felvitele: 0,4 g friss levél 2 ml kivonópufferben történő homogenálása, majd a felülúszó Eppendorf-csőben történő centrifugálása 5 percig, vagy a homogenátum vattán történő átszűrése. Inkubálás 4 °C-on egy éjszakán át, majd háromszori desztillált vízzel történő mosás, és kétszeri PBS–Tween mosópufferrel történő mosás következik. Kiöntés előtt a puffert 3 percig hagyjuk a cellákban.

  4. A második IgG réteg felvitele [lásd b lépés].

  5. Protein A-enzim konjugátum felvitele. Előtte a konjugátumot ún. konjugátumpufferrel – a konjugátum minőségétől függően – hígítjuk (pl. 20 ml pufferben 5 µl konjugátumot oldunk). Ezután a lépés után az inkubáció 4 órán keresztül 35 °C-on történik, majd a c lépés szerinti mosás következik.

  6. A szubsztrátum felvitele. Ha az enzim alkalikus foszfatáz, akkor a szubsztrát 4-nitrofenil-foszfát. Ha az enzim peroxidáz, akkor a szubsztrát o-fenilén-diamin lesz.

  7. A szubsztrát felvitele után a reakcióelegyet 35 °C-on inkubáljuk. A pozitív minták esetében rövid idő alatt kialakul a narancssárga színreakció.

  8. Ha az enzim alkalikus foszfatáz volt, a reakciót cellánként 50-50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk.

  9. A lemezt ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük.

O-fenilén-diamin (OPD) készítése:

  1. 1 kapszula OPD-t 50 ml citromsavas foszfátpufferben feloldunk. Az OPD erősen rákkeltő hatású, ezért gumikesztyű használata kötelező. Az OPD fényérzékeny, ezért feloldásakor a főzőpoharat alufóliába kell csomagolni és a bemérés után a lemezt is takarni kell.

  2. 50 ml bidesztillált vízben 1 tabletta Hyperolt oldunk fel. H2O2 keletkezik.

  3. A hidrogén-peroxid (H2O2) oldatból 500 μl-t adunk az 50 ml OPD-oldathoz, és kevertetjük. Az így nyert elegyből 150 l mennyiséget pipettázunk a lemez celláiba.

Citromsavas foszfátpuffer készítése:

5,6 g citromsav; 11,2 g Na2HPO4 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 5).

A reakcióhoz szükséges egyéb pufferek (fedő-, azaz coating), PBS–Tween mosópuffer, IgG-puffer, kivonópuffer, konjugátumpuffer – mely ugyanaz, mint az IgG-puffer – elkészítésének módja az előző fejezetben található.

Radioimmuno-vizsgálat (RIA)

A radioimmuno-tesztek során az antitestet nem enzimhez kötik, hanem radioaktív izotóppal jelölik. A költséges számlálószerkezet, valamint a rádioaktív anyagok használata miatt ezt az eljárást a növényi virológiában csak ritkán alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

Immunoblotting

Ezen eljárások az ELISA érzékenységét fokozó, annak továbbfejlesztett változatai. Az immunoblotting eljárásokról nemrégiben kiváló tanulmányok születtek, és alkalmazásuk a növényi virológia területén Koenig és Burgermeister (1986), Hampton et al. (1990) munkáiban részletesen leírásra kerültek. Az immunoblotting diagnosztika három részterületet ölel fel. Ezek a következők: Western blot technika, dot-blot immunteszt (DIA) és a szöveti (tissue) blotting.

A Western blot technika

Ezen eljárás első lépéseként a gélben lévő proteineket először elektroforézissel szétválasztják. Ezután a fehérjék a gélből egy membránra kerülnek, amihez az antitesteket kötik. A proteinek a gélből a legegyszerűbben passzív úton kerülnek a membrán felületére. A nagyobb molekulatömegű fehérjék esetében azonban hatékonyabb az ún. elektroblot immunteszt alkalmazása. Az eljárást Tobwin et al. (1979) fejlesztették ki, melynek lényege röviden a következő: a gélben lévő proteineket először itt is elektroforézissel választják szét. A gél egyik oldalán szűrőpapír, a másik oldalán pedig membrán és szűrőpapír van. Ezt a „szendvicset” elektromos áram alá helyezik, melynek hatására a térerősségtől és a gél vastagságától függően 1–12 óra alatt a fehérjék a szűrőre kerülnek. A termelődött hő elvezetéséről gondoskodni kell. Az újabban elterjedt, ún. „félszáraz” blottolási technika esetében kevesebb mennyiségű puffer felhasználására van lehetőség. A fehérjék membránra történő átjutási ideje nagyon rövid, 0,5–0,75 mm gélvastagság esetén mintegy 30 perc.

Dot-blot immunteszt

Banttari és Goodwin (1985) nyolcszoros érzékenységnövekedést ért el azzal, hogy az ELISA-eljáráshoz nem polisztirol lapot, hanem nitrocellulóz membránt használt. A membránt apró korongokra darabolva, vagy műanyag sablonba szorított nagyobb membránszelet formájában használják. Utóbbi esetben a sablonból kivett membránon színes foltok (dot) formájában láthatók a pozitív reakciók.

A dot-blot technika esetén a tisztított antigént vagy a szövetnedvet közvetlenül a nitrocellulóz membránhoz kötik, a műveletet megelőző elektroforetikus szétválasztás nélkül (Banttari és Goodwin, 1985; Hibi és Saito, 1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A BSA-val (bovin-szérumalbumin) történő telítés után a blottokat sorrendben antitesttel, IgG-enzim konjugátummal, majd a szubsztrátummal inkubálják, mint a Western blot teszt során. A technika monoklón és poliklón antitestek esetén is alkalmazható (Rocha-Pena et al., 1991). Ezzel az eljárással az alkalmazandó reagensek kis mennyisége miatt fél pikogram-mennyiségű vírus is kimutatható.

  • A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatása dot-blot technikával (Moya et al., 1997)

  1. Növényi minta előkészítése. Egy gramm levelet 40 ml Tris-HCl-ben homogenálunk (pH 6,8), amely 30 mM aszkorbinsavat és 0,2% 2-merkaptoetanolt tartalmaz. A keveréket öt percig 100 °C-on történő felmelegítéssel denaturáljuk.

  2. A nitrocellulóz membránt óvatosan a TBS-puffer felszínére helyezve megnedvesítjük.

  3. A membránt öt percig szűrőpapíron szárítjuk (ma már olyan membránok is léteznek, melyek használatánál a b és a c művelet elvégzése nem szükséges).

  4. 1 μl növényi mintát csepegtetünk a membránra, majd azt 5 percig szűrőpapíron szárítjuk.

  5. A filtert blokkoló oldatban (5% sovány tejport tartalmazó PBS-oldat) egy órán keresztül rázatjuk, majd egy pillanatra desztillált vízbe mártjuk.

  6. Monoklón antitesttel kezeljük a szűrőt (0,1 g/ml PBS-oldatban).

  7. Ezután desztillált vízbe történő bemártás, 2 × 10 percig TTBS-oldatban történő mosás, majd ismételten egy pillanatra desztillált vízbe történő bemártás következik.

  8. A szűrőt peroxidázzal jelzett „antiegér“ antiszérumban inkubáljuk.

  9. Desztillált vizes bemártás, majd 10 percig TTBS-ben, és 10 percig TBS-ben történő gyenge rázatás következik.

  10. A membránt öt percig az előhívó oldatban előhívjuk.

  11. Desztillált vizes öblítés után az értékelés következik.

TBS-puffer: 0,02M-os Tris-HCl; 0,5M-os NaCl (pH 7,5).

TTBS-puffer: 0,05%-os Tween 20 TBS pufferben.

Előhívó oldat: 6 ml dimetil-szulfoxid; 0,1 g 3 amino-9 etil-karbazol; 50 ml 0,02 M-os

nátrium-acetát-puffer (pH 5,1); 0,4 ml hidrogén-peroxid. Frissen készítendő!

Szöveti (tissue) blotting

Ez az eljárás a dot-blothoz hasonló, de nincsen szükség a növényi minta homogenálására. A friss növénymintát egyszerűen rányomjuk a nitrocellulóz membránra, majd a dot-blot eljárás szerint „előhívjuk” (Lin et al., 1990).