Az elnevezés onnan származik, hogy ha megfelelő mennyiségű antigén és antitest találkozik egymással, akkor a reakció látható csapadékképződésben nyilvánul meg. A növényi minta szövetnedvét összekeverjük az antiszérummal. Az inkubálás után szabad szemmel vagy mikroszkóppal értékelünk. Amennyiben az antigén (azaz a keresett vírus) jelen volt a szövetnedvben, akkor az antigén–antitest reakció következtében apró pelyhekből álló csapadék keletkezik. A precipitációs tesztek a legrégebben alkalmazott eljárások az antigén–antitest kölcsönhatások tanulmányozására (Heidelberger és Kendall, 1935; Kleczkowski, 1966). A precipitáció és az agglutináció elkülönítése a reagáló antigén mérete alapján történik. A precipitáció a makromolekulák és a vírusrészecskék oldhatatlanságára utal, míg az agglutináció a sejtek, ill. a hozzá hasonló méretű részecskék összetömörülését jelenti.

Folyékony közegben történő precipitációs teszt

A precipitációs tesztek eredményességét számos tényező befolyásolja. Fontos tényező az antigén mérete. A fonál alakú, 500–1000 nm hosszúságú vírusrészecskék már kisebb mennyiségű antitesttel is jól látható precipitációt eredményeznek, mint a kisebb (izometrikus) virionok vagy a disszociált fehérjealegységek (Van Slogteren és Dubs, 1993). A titerérték általában 10^–3, ill. 10^–4 a fonál alakú vírusoknál, míg a disszociált vírusalegységeknél ritkán magasabb, mint 10^–2.

Az antigén–antitest reakció kémcső helyett lejátszódhat tárgylemezen, vagy Petri-csészében is (Wetter, 1965; Noordam, 1973; Dijkstra és De Jager, 1998). Ezek az ún. mikroprecipitációs tesztek. Tárgylemez használata esetén az üvegfelületet hidrofóbbá kell tenni szilikonnal vagy 0,1%-os formvarral. Ha a reakció Petri-csészében történik, akkor az evaporáció elkerülése végett ásványi olajat kell rétegezni a felületre. A lemezeket nedves kamrában kell tartani. A csapadékképződést szobahőmérsékleten 0,5–1 órás inkubálás után mikroszkóppal lehet megfigyelni. 4 °C-on hosszabb, mintegy 6 órás inkubációs idő szükséges. A mikroprecipitáció cseppben történő lejátszódásának fő előnye a reagensek gazdaságos felhasználása.

A precipitációs tesztek másik altípusa az, mikor az antiszérum 10–30%-os glicerines sóoldatban hígítva egy kis kémcső aljára kerül, amire úgy rétegzik rá az antigént, hogy a kettő között éles határfelület képződjön. Pozitív reakció esetén a határfelületen precipitációs gyűrű alakul ki. E módszer előnye, hogy a reagensek koncentrációja kevéssé kritikus. Többféle vírus kimutatására sikeresen alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

A precipitációs teszteket vagy tisztított víruspreparátummal végzik, vagy a fertőzött növény leszűrt szövetnedvével. Ha a vírus a gazdanövényében csak nagyon kis koncentrációban van jelen, akkor szükséges a növényi szövetnedvet ultracentrifugálással koncentrálni.

A folyadékprecipitációs tesztek fő alkalmazási területe az antiszérum-titerérték segítségével a vírusok jellemzése és a nagyméretű, immundiffúziós tesztekkel nem tanulmányozható vírusok közötti szerológiai rokonság felderítése. Két vírus közötti rokonsági kapcsolat kimutatására jól használható az ún. szerológiai differenciálindex (SDI).

Az agglutinációs reakciókban az antigént vagy az antitestet a vörösvérsejtek vagy egyéb hordozórészecskék, pl. latex szemcsék felületére kötik. Ebben az esetben a sejtek és a latex partikulák mérete miatt látható szerológiai reakció képződik még akkor is, ha a reagensek alacsony koncentrációja a látható precipitációt nem tenné lehetővé. A passzív hemagglutináció esetében a vírusrészecskék vagy az antitestek a vörösvérsejtekhez különböző kémiai kezelések által kötődnek (Rajeshwari et al., 1981; van Regenmortel, 1982), míg a latex tesztnél az antitest egyszerű adszorpcióval kötődik a latex partikulákhoz. Ezért a vírussal (antigénnel) történő pozitív reakció esetén a latex szemcsével megnövelt antitest és a vírusrészecskék aggregálódása következtében a precipitáció láthatósága megnövekszik. Az antitest-molekulák a latex szemcsékhez egy ún. protein A közbülső réteggel is kapcsolódhatnak (Torrance, 1980). Az agglutinációs tesztek érzékenysége 2–3-szor nagyobb, mint a precipitációs vagy az immunodiffúziós teszteké (van Regenmortel, 1982). A zselatinból és különböző színű gumiarábikumból készült, 3 μm átmérőjű zselatinszemcsék szintén sikerrel alkalmazhatók a növényi vírusok kimutatásában.

Az immunodiffúziós tesztek gélben lejátszódó precipitációs tesztek. Két fő változatuk ismert.

Az egyszerű géldiffúzió esetében az antigén diffundál abba a közegbe, amely az antitestet tartalmazza. Az immunodiffúziós teszteknek a növényi virológiában leggyakrabban használt változata a kettős (dupla) géldiffúzió, amelyben mind az antigén, mind pedig az antitest gélközegbe vágott különálló lyukakban helyezkedik el és egymás felé diffundál (Shepard, 1972). Az immuno-elektronmikroszkópos módszer az immunodiffúziós teszteket és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat együtt tartalmazza. Ezt a módszert részletesen az Immuno-elektronmikroszkópos módszer c. fejezet tárgyalja.

Egyszerű géldiffúzió

A reakció kb. 1 cm-es átmérőjű és 7–8 cm hosszú kémcsőben zajlik le. A kémcső aljára kerül az antiszérummal kevert agar vagy agaróz (szilárd fázis), rárétegezve pedig az antigén folyékony fázisban. A precipitációs gyűrű a kémcső alja felé mozdul el. A mozgás sebessége az antigén diffúziós állandójától, valamint az antigén és az antitest koncentrációjától függ. A többszörös zónák kialakulása különböző antigén-komponensek jelenlétére utal (Oudin, 1952).

Radiál géldiffúzió

Az egyszerű diffúzió másik változata a sugárirányú, ún. radiális géldiffúzió (Vaerman, 1981), ahol az antigén egy központi lyukban helyezkedik el, és az azt körülvevő, antitestet tartalmazó agargélbe diffundál. A lyuk körüli precipitációs gyűrű vastagsága az antigén koncentrációjával arányos.

Kettős géldiffúzió

Az immunodiffúziós tesztek közül a növényvirológiában leggyakrabban az Ouchterlony-féle (1968) kettős diffúziós módszert alkalmazzák. Ennek az a lényege, hogy vékony agarlemezbe lyukakat vágunk úgy, hogy egy középső lyukat 6–8 másik lyuk vegyen körül. A középső lyukba antiszérumot cseppentünk, míg a szélsőkbe a vizsgálandó növényi minták szövetnedvei kerülnek. Az antitestek és az antigének is diffundálnak az agarban. Ahol találkoznak, ott az agarban félhold alakú precipitációs ív keletkezik. A módszer izometrikus és pálcika alakú vírusokra alkalmazható. A hosszú, fonál alakú vírusokat előbb olyan kezelésnek kell alávetni, amely biztosítja a köpenyfehérjék szabad diffúzióját. Miután a reagensek a lyukakba kerültek, az antigén diffúziós együtthatójától függően a diffúzió 24–72 óráig tart. A párolgás gátlása céljából a Petri-csészét nedves kamrában tartjuk, vagy a gél tetejére könnyű ásványi olajréteget helyezünk. A precipitációs ívek a Petri-csészét megvilágítva sötét háttér előtt tisztán látszódnak.

Precipitációs minták

Ha a lyukakban a reagensek megfelelő arányban vannak, akkor a precipitációs ív helyzete és görbülete utal az antigén méretére. Ha az antigén diffúziós koefficiense ugyanakkora, mint az antitestté (5 × 10^–7 cm² s^–1), akkor a precipitációs ív egyenes lesz, és egyforma távolságra helyezkedik el a két lyuktól. Ha a vírusrészecskék diffúziós együtthatója alacsonyabb (0,3–1,6 × 10^–7 cm² s^–1), akkor a precipitációs ív az antigén lyukhoz közel helyezkedik el, és körbefogja azt (van Regenmortel, 1982). Ha két egymás mel-lett elhelyezkedő antigén diffundál ugyanazon antitestforrás felé, akkor a precipitációs ívek találkozásánál különböző minták alakulhatnak ki. Három alapváltozat lehetséges: 1. egybeolvadó (koaleszcens), 2. ívek kereszteződése és 3. sarkantyúképzés (spur), amelyek a két vírus közötti rokonsági kapcsolat meghatározására jól használhatók. Ha a precipitációs ívek összeérnek (koaleszcens minta), akkor a két egymás melletti lyukban elhelyezkedő vírus szerológiailag azonos. Ha a két precipitációs ív keresztezi egymást, a két vírus nincs egymással rokonsági kapcsolatban. A sarkantyú- vagy spurképződés arra utal, hogy a két összehasonlítandó vírus azonos, de különböző epitópokat is tartalmaz (81. ábra).

81. ábra - A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990 után]

Az Ouchterlony-technika alkalmazása Na-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében

A fonál alakú vírusok hosszúságuknak és aggregálódó képességüknek megfelelően a 0,5–1,0%-os agargélben nem diffundálnak. Ahhoz, hogy a gélben történő diffúziót lehetővé tegyük, a részecskéket ultrahanggal össze kell törni, vagy kémiai úton, alkáli pufferrel, detergensekkel, pirrolidinnel vagy nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kell szétbontani (Purcifull és Batchelor, 1977). Az SDS-t vagy a gélbe keverik, vagy összekeverik az antigénnel, hogy megkönnyítsék a disszociációt. Az eljárást Gooding és Bing (1970) dolgozta ki a hosszú, fonál alakú vírusokra, de ma már más morfológiájú vírusokra, valamint fehérje-zárványtestek detektálására is alkalmazható.

A disszociált köpenyfehérje-alegységek már könnyen diffundálnak, és így lehetővé válik bármely méretű vírus esetében az immunodiffúziós tesztek alkalmazása. A különböző vírusok disszociált alegységei szerológiailag szorosabb rokonságot mutatnak, mint az intakt vírusok, ezért ezzel a megközelítéssel a rokon vírusok vagy vírustörzsek között további keresztreakciókat lehet kimutatni (Shepard et al., 1974; Dijkstra és De Jager, 1998).

A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) meghatározása Ouchterlony-módszerrel SDS jelenlétében (Purcifull és Batchelor, 1977)

Az immunoelektroforézis a gélközegben történő elektroforézis és az immunodiffúzió kombinálása. Hatékony módszer a komplex antigénkeverékek szétválasztására. Technikai leírása és alkalmazhatósága a növényi virológiában Hampton et al. (1990) munkájában részletesen szerepel. Az immunoelektroforézis egyik változata az ún. rocket immunoelektroforézis (Tóbiás et al., 1979; Laurell és McKay, 1981), amelyben az antigén az antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Ha a két reagens találkozik, a precipitációs ív egy rakéta, ill. egy kúpszerű alakzat körvonalaihoz hasonló, a körülhatárolt terület nagysága pedig az antigén koncentrációjával arányos. A módszer 1 mg levélszövetben jelenlévő 1 ng – 0,4 µg mennyiségű vírus kimutatására alkalmas (Hagen et al., 1982).

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) meghatározása rocket immunoelektroforézissel (Tóbiás et al., 1979; Burgyán és Gáborjányi, 1984)

Az „ELISA” mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először növényvírusok kimutatására.

Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és Bar-Joseph, 1984). Direkt és indirekt ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle változat lehetséges (82A–F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását, ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy „kettősszendvics-módszer”) igen specifikus, pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem az antitesthez kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal szemben.

82. ábra - A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, _• = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, _• = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, _• = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, _• = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: _• = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: _• = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum [Hampton et al., 1990 után]

Direkt ELISA

A növényvirológiában a leggyakrabban az ún. duplaellenanyag-szendvics (double antibody sandwich) módszert alkalmazzák (DAS ELISA) a fertőzések kimutatására. A vizsgálatokhoz ún. mikrotitráló lapokat használunk, amelyek polisztirolból készülnek, és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel (mintahely) rendelkeznek.

Először az IgG oldatot pipettázzuk a cellákba. Az inkubálás során az IgG molekulák a poliszirolhoz kötődnek, ezáltal a lap mélyedéseinek felszíne IgG molekulákkal lesz kibélelve. A nem kötődött IgG molekulákat mosópufferrel eltávolítjuk. Ezután a cellákba a növényi minták szövetnedvei kerülnek. Amennyiben a minta tartalmazta azt az antigént (vírust), amely ellen a kötődött IgG is készült, akkor a vírus a lemezhez kötött IgG-hez kapcsolódik, míg a növényi fehérjék és más vírusok nem. Inkubálás után a nem kötődött anyagok a cellákból pufferrel kimoshatók. Ezután pipettázzuk a cellákba a második, enzimmel jelzett IgG-t, azaz a konjugátumot. Ha a vírus jelen van (az immobilizált IgG-hez kapcsolódva) a cellában, akkor az enzimmel jelzett IgG (konjugátum) a vírus másik feléhez kötődik. Ezáltal létrejön az „immunszendvics”. A nem kötődött konjugátumot pufferes mosással eltávolítjuk, majd az enzim szubsztrátjának oldata kerül a cellákba. A leggyakrabban alkalmazott enzim, az alkalikus foszfatáz esetében a szubsztrát para-nitro-fenil-foszfát, amely színtelen vegyület. Az alkalikus foszfatáz enzim a szubsztrátmolekulákról elkezdi hasítani a foszfátcsoportokat, amelynek eredményeként sárga színű para-nitro-fenol keletkezik. A színváltozás erőssége közvetve a vírus koncentrációjával arányos. Az enzim addig működik, amíg megfelelő kémiai környezet és szubsztrát jelen van. A pozitív reakció szemmel is jól látható, de általában ELISA-értékelő fotométerrel (ELISA reader) értékelik az eredményeket (82A ábra).

Az antigén kötődik először a mikrotitráló lemez falához (82E ábra). Ebben az esetben az antigén kötődik először a cella falához, majd megfelelő mosás után az antitest és az enzim konjugátumát, végül pedig az enzim szubsztrátumát adjuk a cellába, ahogyan az a DAS ELISA eljárásnál is történik.

A szokványos ELISA-teszttel szemben, ahol az antitesthez kapcsolják az enzimet, a biotin-avidin rendszer növeli a reakciók érzékenységét és szélesebb körű szerológiai rokoni kapcsolatok feltárását teszi lehetővé. Viszonylag régóta ismert, hogy a tojásfehérjében található egy avidinnek nevezett fehérje, amely a biotinhez (H-vitamin, koenzim R) kapcsolódva megakadályozza a biotinnek a belekből történő felszívódását. Később a Streptomyces avidini baktérium egyik fehérjéjéről is hasonló tulajdonságot mutattak ki. E fehérjét sztreptavidinnek nevezik. Mindkét anyag alkalmas a diagnosztikai felhasználásra. A sztreptavidin fizikai tulajdonságai azonban jobbak, ezért ennek a felhasználása terjed. A módszer alapváltozatában az IgG-t biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. Az antitesthez kapcsolt biotin az antitest aktivitását kevésbé csökkenti, mint az enzim. Az eljárás röviden a következő:

Az eljáráshoz szükséges a vírus kimutatására alkalmas ELISA kit (Boehringer, Sanofi, Loewe), amely tartalmazza az antiszérumot és az antiszérum–enzim konjugátumot, valamint a pozitív és negatív növényi kontrollmintákat.

Indirekt ELISA

Az első lépésben csak a specifikus IgG F(ab’)₂ fragmentuma kapcsolódik a lemezhez. Pufferes mosás után a minta becsepegtetése és az antigén megkötődése következik. Ezt követően ismét mosás következik, majd a következő műveletben a teljes IgG-t mérik be, amely az immobilizált antigénhez (vírushoz) kötődik. Ez az IgG nincs enzimmel jelölve. A protein A-nak nevezett sejtfalfehérje – amelyet a Staphylococcus aureus nevű baktérium termel – jellemző tulajdonsága az, hogy kötődik az IgG molekulák nem antigénspsecifikus F(c) régiójához. Ezt a protein A-t ugyanúgy lehet enzimmel jelölni, mint az IgG molekulákat. Ha az indirekt ELISA utolsó előtti lépésekor ilyen enzimmel konjugált protein A-t pipettázunk a lyukakba, akkor az csak a teljes IgG molekulákhoz kapcsolódik, az antigén hiányában esetleg „csupaszon” maradt F(ab’)₂ fragmentumokhoz nem. Az utolsó lépés ebben az esetben is az enzim szubsztrátjának a bevitele. E változatnál nem kell minden vírus ellen termeltetett IgG-t külön-külön enzimmel konjugálni, elég a protein A-enzim konjugátum használata. Az indirekt módszer elnevezés arra utal, hogy az enzim nem közvetlenül a specifikus IgG-hez van kapcsolva (82B ábra).

E vizsgálatban először a vírus ellen egy állatfajban (1. állat) termeltetett IgG-vel érzékenyítjük a lemezt. Ezután becsöpögtetjük a növényi mintát. A megfelelő inkubálás és mosások után egy másik állatfajban (2. állat) ugyanarra a vírusra specifikusan termeltetett IgG kerül a lyukakba. Ezután a 2. állat IgG-je ellen termelt 3. állat IgG-enzim konjugátuma következik. Végül pedig az enzim szubsztrátja kerül a cellába (82C ábra).

Először az antigént kötjük a lemez falához, majd az IgG-t. Ezt követi az első állatfaj IgG-je ellen egy másik állatfajban termeltetett IgG-enzim konjugátuma, majd a szubsztrátum hozzáadása (82F ábra).

Ennél a változatnál a protein A fehérjét kétszer kell bevinni a cellába (Edwards és Cooper, 1985). Először a protein A réteget a cella falához kötjük, amihez a továbbiakban az antitest kötődik. A vírussal és a második antitestréteggel történő inkubáció után enzimmel konjugált protein A-t adunk a második réteg antitest-detektálása céljából. E módszer legfőbb előnye, hogy csak egyféle antiszérum szükséges hozzá, mivel az enzimet nem az antitesthez, hanem a protein A-hoz kapcsoljuk (82D ábra).

O-fenilén-diamin (OPD) készítése:

Citromsavas foszfátpuffer készítése:

5,6 g citromsav; 11,2 g Na₂HPO₄ 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 5).

A reakcióhoz szükséges egyéb pufferek (fedő-, azaz coating), PBS–Tween mosópuffer, IgG-puffer, kivonópuffer, konjugátumpuffer – mely ugyanaz, mint az IgG-puffer – elkészítésének módja az előző fejezetben található.

A radioimmuno-tesztek során az antitestet nem enzimhez kötik, hanem radioaktív izotóppal jelölik. A költséges számlálószerkezet, valamint a rádioaktív anyagok használata miatt ezt az eljárást a növényi virológiában csak ritkán alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

Ezen eljárások az ELISA érzékenységét fokozó, annak továbbfejlesztett változatai. Az immunoblotting eljárásokról nemrégiben kiváló tanulmányok születtek, és alkalmazásuk a növényi virológia területén Koenig és Burgermeister (1986), Hampton et al. (1990) munkáiban részletesen leírásra kerültek. Az immunoblotting diagnosztika három részterületet ölel fel. Ezek a következők: Western blot technika, dot-blot immunteszt (DIA) és a szöveti (tissue) blotting.

A Western blot technika

Ezen eljárás első lépéseként a gélben lévő proteineket először elektroforézissel szétválasztják. Ezután a fehérjék a gélből egy membránra kerülnek, amihez az antitesteket kötik. A proteinek a gélből a legegyszerűbben passzív úton kerülnek a membrán felületére. A nagyobb molekulatömegű fehérjék esetében azonban hatékonyabb az ún. elektroblot immunteszt alkalmazása. Az eljárást Tobwin et al. (1979) fejlesztették ki, melynek lényege röviden a következő: a gélben lévő proteineket először itt is elektroforézissel választják szét. A gél egyik oldalán szűrőpapír, a másik oldalán pedig membrán és szűrőpapír van. Ezt a „szendvicset” elektromos áram alá helyezik, melynek hatására a térerősségtől és a gél vastagságától függően 1–12 óra alatt a fehérjék a szűrőre kerülnek. A termelődött hő elvezetéséről gondoskodni kell. Az újabban elterjedt, ún. „félszáraz” blottolási technika esetében kevesebb mennyiségű puffer felhasználására van lehetőség. A fehérjék membránra történő átjutási ideje nagyon rövid, 0,5–0,75 mm gélvastagság esetén mintegy 30 perc.

Dot-blot immunteszt

Banttari és Goodwin (1985) nyolcszoros érzékenységnövekedést ért el azzal, hogy az ELISA-eljáráshoz nem polisztirol lapot, hanem nitrocellulóz membránt használt. A membránt apró korongokra darabolva, vagy műanyag sablonba szorított nagyobb membránszelet formájában használják. Utóbbi esetben a sablonból kivett membránon színes foltok (dot) formájában láthatók a pozitív reakciók.

A dot-blot technika esetén a tisztított antigént vagy a szövetnedvet közvetlenül a nitrocellulóz membránhoz kötik, a műveletet megelőző elektroforetikus szétválasztás nélkül (Banttari és Goodwin, 1985; Hibi és Saito, 1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A BSA-val (bovin-szérumalbumin) történő telítés után a blottokat sorrendben antitesttel, IgG-enzim konjugátummal, majd a szubsztrátummal inkubálják, mint a Western blot teszt során. A technika monoklón és poliklón antitestek esetén is alkalmazható (Rocha-Pena et al., 1991). Ezzel az eljárással az alkalmazandó reagensek kis mennyisége miatt fél pikogram-mennyiségű vírus is kimutatható.

TBS-puffer: 0,02M-os Tris-HCl; 0,5M-os NaCl (pH 7,5).

TTBS-puffer: 0,05%-os Tween 20 TBS pufferben.

Előhívó oldat: 6 ml dimetil-szulfoxid; 0,1 g 3 amino-9 etil-karbazol; 50 ml 0,02 M-os

nátrium-acetát-puffer (pH 5,1); 0,4 ml hidrogén-peroxid. Frissen készítendő!

Szöveti (tissue) blotting

Ez az eljárás a dot-blothoz hasonló, de nincsen szükség a növényi minta homogenálására. A friss növénymintát egyszerűen rányomjuk a nitrocellulóz membránra, majd a dot-blot eljárás szerint „előhívjuk” (Lin et al., 1990).