Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

15. fejezet - A nukleinsavak jellemzésének módszerei

15. fejezet - A nukleinsavak jellemzésének módszerei

A vírusok genetikai információját hordozó nukleinsav típusa lehet ribonukleinsav (RNS) vagy dezoxiribonukleinsav (DNS). Ezek egyszálúak (ssRNS, ssDNS) vagy kétszálúak (dsRNS, dsDNS) lehetnek, de a virionképzésben csak egyféle nukleinsav vehet részt. A vírus-RNS-szál lehet pozitív vagy negatív. Pozitívnak nevezzük akkor, ha róla közvetlenül transzláció valósul meg, azaz messenger RNS-ként (mRNS) funkcionál. A növénypatogén vírusok túlnyomó többsége egyszálú pozitív RNS-genomot tartalmaz, az egy-, ill. kettős szálú DNS vírusok száma csekély. A növényvírusok kisebb része negatív szálú RNS-vírus; ebben az esetben szükség van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A vírusokban a nukleinsavbázisok sorrendje meghatározó, hiszen a nukleinsavakban foglalt információk felelősek a fertőzőképességért, a vírusreplikációért, a fehérjék szintéziséért, beleértve a köpenyfehérje termelését is. A vírusgenom lehet egykomponensű, azaz osztatlan és lehet többkomponensű, azaz osztott. A vírusgenom minősége, a nukleinsav-molekulák száma, a genom szerveződése és kifejeződése alapvető jelentőségű a vírusok rendszerezésében (Matthews, 1991, 1992).

A nukleinsav jellemzésére alkalmas első technikák kifejlesztését a viroidok felfedezése és későbbi vizsgálatai motiválták, hiszen a viroidok esetében nincsen lehetőség fehérjék vizsgálatára. Mint ismert, a viroidok csupasz (naked) RNS-ből állnak. A molekuláris biológia és a biotechnológia területén elért eredmények szintén nagymértékben hozzájárultak ahhoz, hogy lehetővé vált a vírusnukleinsav mind diagnosztikai, mind rendszertani célú jellemzése, a genomban kódolt fehérjék szerepének megértése és a genom génsebészeti célokra történő felhasználása.

A nukleinsavak jellemzésének egyik legáltalánosabban használt technikája a gél-elektroforézis, amely lehetővé teszi a nukleinsavak elválasztását, méretének meghatározását. A nukleinsav jellemzésére használt, ún. hibridizációs módszerek különösen olyan növényvírusok vizsgálatában terjedtek el, ahol a szerológia nem ad megbízható eredményt [pl. dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) esetében]. A nukleinsav-hibridizáció gyors eljárása a dot-blot hibridizáció, amely azonban nem teszi lehetővé a nukleinsav méretének meghatározását, ehhez DNS esetében Southern-, RNS esetében pedig Northern-hibridizációra van szükség.

A nukleinsav jellemzésének legfontosabb és legalaposabb módszere a teljes genom bázissorendjének, azaz szekvenciájának meghatározása. A növényvírusok esetében erre azért van lehetőség, mert a genom kis méretű, általában kisebb, mint 10 000 bázispár. A genom teljes szekvenciájának megismerése új szempontokat adott a vírusok rendszerezéséhez, hiszen lehetővé tette a rendszerezésben az evolúciós összefüggések figyelembevételét is. A molekuláris biológiában széles körben alkalmazott polimeráz-láncreakció (polimerase chain reaction, PCR) használata a növényvírus-diagnosztikában és a molekuláris virológiában egyaránt ismert. A továbbiakban a nukleinsav jellemzésére alkalmas technikák részletes ismertetésével foglalkozunk. Megemlítjük, hogy e témával kapcsolatban a könyv kéziratának leadása után jelent meg Dijkstra és De Jager (1998) kitűnő könyve a vírus-RNS vizsgálati módszereiről.

Gél-elektroforézis

A gél-elektroforézis lehetővé teszi a nukleinsavak elválasztását és méretének meghatározását. A technika lényege az, hogy az elektromos térbe helyezett gélben a molekulák a gél pórusain keresztül az ellenkező töltés irányába vándorolnak.

A negatív töltésű nukleinsavak gélben történő mozgását sok tényező befolyásolja, de megfelelően standardizált körülmények között a vándorlás gyorsaságát a legnagyobb mértékben a molekula mérete határozza meg. Minél kisebb a molekula, annál könnyebben, gyorsabban mozog. Megfelelő méretű ismert anyag (marker) alkalmazásával a molekula pontos mérete is megállapítható. A technika egyszerű, gyors és olyan fragmentumok elválasztására is alkalmas, amelyre más úton, pl. sűrűséggradiens-centrifugálással nincs mód.

A vizsgált molekulák a gélen könnyen láthatóvá tehetők egy alacsony koncentrációban használatos fluoreszcens festék, az ehídium-bromid alkalmazásával. Ennek segítségével ultraibolya fényben már 1–10 ng DNS is kimutathatóvá válik. A gél agarózból vagy poliakril-amidból készülhet, a feladatnak megfelelő alakban, sűrűségben és méretben. Az agarózgéleket általában a magasabb mérettartományban alkalmazzák, mintegy 200 bázispártól (bp) egészen 50 kilobázisig (kb). A poliakril-amid gélek kiválóan alkalmasak kisebb méretű molekulák (5–500 bp) elválasztására. Felbontóképességük olyan nagy, hogy különböző DNS-fragmentumok összehasonlításakor már 1 bp-nyi különbség is észlelhető (Sambrook et al., 1989).

A gél-elektroforézisnek a növényvirológiában elsősorban a vírusgenom (RNS vagy DNS) méretének, illetve a genom bázissorendjének meghatározásában van szerepe. A 83. ábra az agarózgél-elektroforézis vázlatát mutatja.

83. ábra - A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után]

A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után]