Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek
dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard
Mezőgazda Kiadó
A hibridizáció egyszálú nukleinsavláncok specifikus bázispárosodását jelenti, a purin és pirimidin bázisok egymásnak megfelelősége, a komplementaritás szabálya szerint. A kétszálú DNS két szálát hevítéssel vagy lúgos kezeléssel eltávolítva egymástól (denaturálás) egy egyszálú DNS-molekulákat tartalmazó oldat keletkezik, és az így kapott DNS-oldat lehűlésekor a kétszálú szerkezet újra kialakul (renaturálódás). Azt a hőmérsékletet, amelyen a molekulák 50%-a denaturálódik, olvadási hőmérsékletnek (Tm) nevezzük. Az olvadási hőmérsékletet alapvetően a következő faktorok befolyásolják: 1. a nukleinsav bázisösszetétele, azaz a magas G+C-tartalomnál magasabb a Tm értéke; 2. a sókoncentráció, ugyanis a magas sókoncentráció növeli az olvadási hőmérsékletet; 3. a hidrogénkötést befolyásoló kémiai anyagok (pl. formamid) jelenléte csökkenti a Tm-et. A hibridizációs tesztekhez olyan hőmérsékleti körülményeket kell választani, amelyek maximalizálják az asszociáció fokát a komplementer szálak között. Ez általában 22–27 °C-kal kevesebb a Tm-nél, azaz kb. 65 °C (Matthews, 1991).
A már oldatban levő molekulákhoz komplementer RNS-t vagy DNS-t adva olyan molekulák is képződnek, amelyeknek egyik szálát a hozzáadott komplementer RNS vagy DNS alkotja. Ha ezeket a molekulákat a felismerhetőség érdekében radioaktív vagy más módon jelölik, akkor a kapott hibrid molekulák is kimutathatóvá válnak. A jelölt RNS-t vagy DNS-t próbának nevezik, amely olyan molekulákhoz kapcsolódik (hibridizál), amelynek vele azonos (homológ) a szekvenciája (Hames és Higgins, 1985).
A hibridizáció megvalósítható úgy is, hogy mindkét nukleinsav oldatban van (folyadék-hibridizáció), de jobban elterjedt az a gyakorlat, amikor az egyik molekulát egy szilárd mátrixon, filteren immobilizálják (filter-hibridizáció). A növényvirológiában általánosan alkalmazott dot-blot, Southern- és Northern-hibridizáció mellett érdemes említést tenni az ún. szendvics-hibridizációról is. A nukleinsav-hibridizációs eljárásokról nemrég Hull (1993) írt összefoglaló tanulmányt.
A dot-blot hibridizáció a legáltalánosabban használt módszer nagyszámú minták elemzésére (Dijkstra és De Jager, 1998). A hibridizáláshoz el nem választott nukleinsavmintát rögzítenek egy megfelelő hordozón (nitrocellulóz vagy pozitív töltésű nejlonmembránon), és erre radioaktív próbát hibridizálnak. Fő lépései a következők: 1. a vizsgálandó növényekből kis mennyiségű szövetnedv- vagy össznukleinsav-kivonás; 2. a nukleinsav denaturálása hevítéssel; 3. a szövetnedvből, ill. a nukleinsavoldatból egy cseppnek a membránra történő felvitele; 4. a nukleinsav membránhoz kötése; 5. a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása a prehibridizáció során; 6. hibridizálás radioaktívan jelölt nukleinsavpróbával; 7. a filter mosása a nem-, illetve aspecifikusan hibridizált próba eltávolítására; 8. a filter szárítása, majd kazettában röntgenfilm fölé helyezése; 9. a film előhívása.
A nukleinsav dot-blot hibridizáció (Hames és Higgins, 1985 után)
Összes nukleinsav-kivonás
A vizsgálandó növényekből egy Eppendorf-tető nagyságú levélkorongot 400 µl kivonó-pufferrel [50 mM Tris-HCl (pH 7,6); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% SDS; 0,3% merkapto-etanol] dörzsmozsárban homogenálunk.
A homogenátumot visszapipettázzuk egy Eppendorf-csőbe, hozzáadunk 400 µl fenolt és 30 mp-ig Vortexben keverjük.
Vortexelés után a homogenátumot 5 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C).
A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 150 µl fenolt és 150 µl kloroformot, majd 30 percig vortexeljük.
A fenolos oldatot 5 percig centrifugáljuk (14000 rpm, 4 °C).
A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 300 µl kloroformot, összerázzuk, majd 5 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C).
A felülúszót leszívjuk és a nukleinsavakat 200 µl ammónium-acetát jelenlétében 1 ml absz. etanollal kicsapjuk, az oldatot 20 percig –70 °C-on tartjuk.
Az alkoholos oldatot 20 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C), majd óvatosan leöntjük a felülúszót.
A csapadékban lévő nukleinsavakat 1,5 ml 70%-os etanollal mossuk (nem szuszpendáljuk).
Centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C). A felülúszót leöntjük, és a csapadékot beszárítjuk.
A csapadékot 30–40 µl steril vízben szuszpendáljuk.
Megjegyzés: Az összes nukleinsav-kivonás során biztosítani kell, hogy az RNS ne degradálódjon, ezért gondoskodni kell az oldatok és eszközök RNáz-mentességéről. A kivonás folyamán végig kesztyűt kell viselni. A kivonópuffert, a fenolt és a kloroformot hűtőben (4 °C) tároljuk, a sterilezett Eppendorf-csöveket az egyes lépések között jégen tartjuk. A kivont nukleinsav minőségét és mennyiségét agarózgélen futtatva ellenőrizhetjük, illetve a mennyiségét spektrofotométerrel mérhetjük.
A minták előkészítése és membránra vitele
A nukleinsavoldatból 3 µl-t kiveszünk, hozzáadunk 3 µl felvivőpuffert [50% (w/v) deionizált formamid; 6% (w/v) formaldehid; 4,2% (w/v) glicerin; 0,035% brómfenolkék; 0,035% xiléncianol; 20mM HEPES pH 7,8; 1 mM EDTA pH 8,0].
A nukleinsavakat 65 °C-on 5 percig denaturáljuk, majd jég közé tesszük.
Az oldatból 4 µl-t pipettázunk a Hybond-N membránra, ügyelve arra, hogy a minták pontszerűen, egymástól kellő távolságban (kb. 1 cm) helyezkedjenek el.
A membránt 2 percre UV-transzparensre helyezzük, hogy a nukleinsavakat irreverzibilisen a membránhoz kössük.
Előhibridizáció, hibridizáció, autoradiográfia
A filtert egy, az egyik oldaláról nyitott műanyag tasakba tesszük, és hozzáadunk 5 ml előhibridizációs oldatot (5 × SSPE; 5 × Denhard oldat; 1,5% SDS; 50% formamid; 19% H2O; 1 mg élesztő-RNS).
A tasakot lezárjuk, és 42 °C-os vízfürdőben rázatva 30 percig előhibridizálunk.
A tasak egyik oldalát felnyitva, hozzáadjuk az elkészített próbát (80 µl), és egy éjszakán át 42 °C-os termosztátban hibridizálunk.
A filtert mosófolyadékkal (1 × SSC; 0,1% SDS) 3 × 20 percig mossuk.
A filtert megszárítjuk, kazettába helyezzük, tetejére pedig röntgen-filmet teszünk.
A filmet 24–48 óra elteltével előhívjuk.
Próbakészítés (T7 QuickPrime Kit, Pharmacia Biotech)
Mérjük össze a következő reakcióelegyet: 17 µl hődenaturált DNS (25–50 ng); 5 µl reagenskeverék (reagent mix); 0,5 µl T7 polimeráz (Pharmacia, 10 u/µl); 2,5 µl [32P]dCTP (1 MBq).
A reakciót 5–15 percig 37 °C-on inkubáljuk.
A mintához hozzáadunk 75 µl 1,5%-os SDS-t, és az így kapott 100 µl próbából 25 µl-t használunk egy hibridizációban, a többit –20 °C-on 2–3 hétig tárolhatjuk.
A felhasználandó 25 µl próbát 25 µl 0,5%-os SDS és 10 µl 1 n NaOH hozzáadásával 5 percig szobahőmérsékleten denaturáljuk, majd 5 percre jégbe tesszük, és hozzáadunk 10 µl 1 n HCl-t és 10 µl 1 n Tris-HCl-t (pH 7,6).
Az így elkészült próbát a prehibridizáló folyadékhoz adjuk.
A Southern-hibridizáció lényege (84. ábra), hogy az agarózgél-elektroforézissel elválasztott DNS-fragmentumokat változatlan mintázatban egy membránra viszik át. A szokásos módon készített gélt lúgban áztatva a DNS-t denaturálják, majd savval semlegesítik. Az így előkezelt gélt egy megfelelő oldattal átitatott szűrőpapírra fektetik, a gél felületére pedig ráhelyezik a membránt. Az egészet lefedik egy vaskos köteg szűrőpapírral, amely szívni kezdi a nedvességet (blottolás, 85. ábra). Miközben a papír a gélen és a membránon átszívja a folyadékot, a DNS is az oldattal együtt mozog, amikor azonban eléri a membránt, ott megkötődik, rögzül. A membránhoz kötött DNS-molekulákhoz radioaktívan jelölt próbát hibridizálnak. A próbával homológ DNS-molekulák autoradiográfiával kimutathatók (Sambrook et al., 1989). A Southern-hibridizáció a növényvirológiában általánosan elterjedt a vírusok polimeráz láncreakciós vizsgálatával kapott, ún. PCR-termékek végső azonosításában. A Southern-hibridizáció (PCR termékek azonosítására) lépései a következők: polimeráz láncreakció (lásd a Polimeráz láncreakció (PCR) c. fejezetet), elektroforézis, blottolás, előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia.
![A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után]](kepek/084-nvir.jpg)
![A blottolás [Sambrook et al., 1989 után]](kepek/085-nvir.jpg)
Elektroforézis
A vizsgálandó PCR termékeket 1–1,5%-os agarózgélben elektroforézissel elválasztjuk.
A gélt denaturáló oldatot (0,6 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl; pH 7,0) tartalmazó kádba helyezzük és 30 percig inkubáljuk.
A denaturáló oldat helyére neutralizáló oldatot (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0) teszünk, majd 30 perces inkubáció következik.
A gélt a 85. ábrán látható módon, egy éjszakán át blottoljuk, a blottoláshoz 20 x SSC-puffert kell használni.
A filtert szárítjuk, majd 2 percig az UV-transzparensre helyezve fixáljuk.
Az elektroforézis után a blottolás, előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia történik, a dot-blot hibridizációnál leírtak szerint.
A Northern-hibridizáció elve megegyezik a Southern-hibridizációval, de a vizsgálandó anyag itt nem DNS, hanem RNS. Az RNS-sel való munka sokkal nagyobb elővigyázatosságot igényel, mint a DNS-sel történő eljárások, mert az RNS nagyon bomlékony. Ezért gondoskodni kell arról, hogy a teszthez használt minden eszköz és oldat RNáz-mentes legyen. A vizsgálatban az RNS-t olyan, ún. denaturáló agarózgélben választják el, amely biztosítja az RNS másodlagos szerkezetének bontását. A leggyakrabban használt denaturáló ágensek a formaldehid és a glioxál. A gélen történő szeparálás után ugyanazon lépések következnek, mint a Southern-hibridizációban, azzal a különbséggel, hogy itt nincs szükség a gél futtatás utáni denaturálására és neutralizálására.
A Northern-analízis alkalmazása különösen elterjedt a vírusgenom bizonyos részeivel transzformált növényekben (transzgénikus növények) a transzgén expressziós szintjének meghatározására.
A Northern-hibridizáció (Sambrook et al., 1989 után)
Az összes nukleinsav kivonásával nyert oldatból 8 µl-t használunk kiindulási anyagként.
Az RNS-mintához hozzáadunk 8 µl mintapuffert, majd a kapott oldatot 65 °C-on 5 percig denaturáljuk, ezután pedig 2 percre jégbe tesszük.
A mintákat (mindig szerepeljen pozitív és negatív kontroll) denaturáló gélen, denaturáló futtató pufferben elektroforetizáljuk.
Futtatás után a gélt 30 percig 10 x SSC-ben áztatjuk, majd a 85. ábra szerint blottoljuk.
A filtert szárítjuk, majd 2 percig UV-transzparensre helyezve az RNS-t rögzítjük.
Ezt követően a dot-blot hibridizációnál leírtak szerint következik a prehibridizáció, a hibridizáció és az autoradiográfia.
A szendvics-hibridizáció (86. ábra) során a vizsgálni kívánt vírus genomjából két egymással nem átfedő szakaszt kiválasztanak, ezeket klónozzák, majd az egyik szakaszt csapdaként használják és egy, az ELISA-módszernél használatos mikrotiterlemez falához kötik. Ha ilyen mintahelyekbe az adott vírust tartalmazó szuszpenziót pipettáznak, akkor a csapda megköti a hibridizáló vírusrészecskéket. A nem kötődött anyagot mosással eltávolítják. Ezután a másik klónt, a másik genomdarabot viszik a lyukakba, de ez a klón már jelölve van (pl. alkalikus foszfatázzal), így a vírus-RNS koncentrációjával arányos hibridizációs szignál (színreakció) megfelelő műszer segítségével mennyiségileg is értékelhető.
![A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán]](kepek/086-nvir.jpg)
A hibridizáció során alkalmazott próba egy olyan RNS- vagy DNS-fragmentum, amely homológ a vizsgálandó molekulával. Az RNS-sel való bánásmód sok körültekintést igényel, ezért sokkal gyakoribb a DNS-próbák használata. A virológiában a vírus egy részéről készült komplementer DNS-klón (cDNS) használatos próbakészítéshez. A cDNS-klón készítésekor (87. ábra) vírus-RNS-ről reverz transzkripció segítségével „elsőszál” cDNS készül. A keletkező elsőszál-cDNS RNS részét RNáz H segítségével részlegesen bontják, és a megmaradó RNS-fragmentumok szolgálnak primerként a DNS-polimeráz I működéséhez, amely szintetizálja a cDNS második szálát. A cDNS-t restrikciós enzimekkel vágva, az ugyanolyan restrikciós enzimmel hasított vektorba (plazmidba) illesztik, majd a rekombináns plazmidot egy adott baktériumsejtbe transzformálják, és abban felszaporítják. A plazmid a baktériumból bármikor tisztítható, és a kinyert DNS tetszőlegesen használható próbakészítéshez, illetve bármely génsebészeti eljáráshoz. Az egyes DNS-fragmentumok in vitro körülmények között is szaporíthatók polimeráz láncreakció segítségével. Azért, hogy a hibridizáció során keletkező hibridek detektálhatók legyenek, a próbákat jelölni kell. A jelölés történhet radioaktív és nem radioaktív eljárással (Brown, 1990).
![A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után]](kepek/087-nvir.jpg)
A radioaktív jelölési módszerek közül a leggyakoribb a „nick”-transzláció és a primer meghosszabbítás. A nick-transzláció (88. ábra) során a DNáz I-enzimmel kezelt DNS-szálakon nick-ek (nukleinsav-folytonossági hiányok) jönnek létre, amelyeket az Escherichia coli DNS-polimeráz a komplementaritás elve szerint „befoltoz” a négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát felhasználásával, amelyek közül az egyik alfa helyzetben 32P izotópot tartalmaz. A polimerizáció mellett az enzimnek 5’–3’exonukleáz-aktivitása is van, így az eredeti nick tovább bővíthető, a polimeráz halad tovább a láncon, és közben beépíti a jelölt dezoxiribonukleozidokat is.
88. ábra - Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, ⇓: Végső nick pozíció, →→→→ : Jelölt szál [Brown, 1990 után]
![Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, ⇓: Végső nick pozíció, →→→→ : Jelölt szál [Brown, 1990 után]](kepek/088-nvir.jpg)
Az ún. véletlen (random) priming módszerénél a DNS-polimeráz I nagyobb egységét, a Klenow-fragmentumot vagy a T7 DNS-polimeráz enzimet használják. A reakció során a jelölendő DNS-t denaturálják, majd random hexanukleotidokat, polimeráz enzimet, alfa-32P dezoxiribonukleozid-trifoszfátokat adnak a reakcióelegyhez. A hexanukleotidok a denaturált DNS-hez hibridizálnak, és primerként szolgálnak. A polimeráz enzim a primerekhez kapcsolódik, és a jelölt bázisokat beépítve meghosszabbítja azokat. E módszerrel a nick-transzlációhoz képest 2–5-szörös specifikus aktivitás érhető el. Napjainkban a PCR-technikával történő próbakészítés is egyre gyakoribbá válik.
A nem radioaktív jelölési módok közül a legelterjedtebb a biotinálás (89. ábra). Ezekben a reakciókban a biotint, mint haptént (biotin-II-dUTP) pl. nick-transzlációval beépítik a próbába, majd a szignált Southern-hibridizáció után két lépésben előhívják. A filtert először a biotinhoz specifikusan kötődő olyan streptavidinnel reagáltatják, amelyhez jelző (reporter) molekulaként alkalikus foszfatáz enzimet kötöttek. Így egy DNS-enzim komplex jön létre. Ha az enzim szubsztrátjával inkubálják a nitrocellulóz filtert, színes csíkok mutatják a hibridek helyét.
![A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után]](kepek/089-nvir.jpg)