Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Nukleinsav-szekvencia meghatározása

Nukleinsav-szekvencia meghatározása

A nukleinsavak bázissorrendjének meghatározására a Maxam és Gilbert (1977)-féle kémiai degradáló és a Sänger és Coulson (1975)-féle láncterminációs módszer ismert, amelyek közül jelenleg a láncterminációs módszert használják. Ahhoz, hogy egy vírus teljes genomjának szekvenciáját meghatározzák, először cDNS-klónokat kell készíteni, mégpedig úgy, hogy ezek a klónok a teljes vírusgenomot átfedjék. A vírusok esetében a kisméretű genom megkönnyíti a szekvencia meghatározását. Nagyobb genomok bázissorrendjének meghatározása már komolyabb feladat, de az automatizált (gépi) szekvenálás terjedésével egyre inkább megvalósítható.

A láncterminációs módszer során a vizsgálandó DNS-t először egyszálúvá teszik. A folyamat kulcsenzime, a DNS-polimeráz I alkalmas arra, hogy az egyszálú DNS kiegészítő szálát elkészítse, de ehhez szükség van egy rövid kétszálas szakaszra is, amely az indító szerepét játssza. Az egyszálú DNS-hez tehát egy rövid oligonukleotid primert hibridizálnak, amelytől kezdődően elindulhat a második szál szintézise. A szekvenáláshoz négy reakció készül, ezek mindegyike tartalmazza a mintául szolgáló egyszálú DNS-t és a hozzá hibridizált primert, valamint tartalmazzák a négyféle nukleozid-trifoszfátot (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) is. A nukleozid-trifoszfátok közül az egyiket radioaktívan jelölik, hogy a termék később kimutatható legyen.Tartalmaznak az elegyek továbbá didezoxi-NTP-t (ddNTP), de mindegyik elegy csak egyfélét. A DNS-lánc felépülését katalizáló polimeráz enzim jelenlétében megindul a mintának megfelelő komplementer szál szintézise. Azok a mesterségesen felépülő szálak azonban, amelyekbe nem dezoxi-nukleozid-trifoszfát (dNTP), hanem ddNTP épül be, nem tudnak tovább gyarapodni, mert a „rossz” nukleozid-trifoszfát ribóz részének 3’-helyzetű szénatomján nincs hidroxilcsoport, így ehhez nem tud kapcsolódni a következő nukleotid. Ha a ddNTP és a dNTP aránya megfelelő, akkor a ddNTP beépülésekor létrejövő lánctermináció statisztikusan úgy oszlik el, hogy az összes lehetséges vég képviselve lesz. A négyféle reakciót párhuzamosan végzik, és az elegyeket poliakril-amid gélre viszik, ahol elektroforézist végeznek. A gél felbontóképessége maximális, azaz már egy nukleotid különbséget is ki tud mutatni. A négy elegynek megfelelően négy oszlop fut párhuzamosan, s a kapott csíkok magasságából megállapítható, hogy melyik szakasz zárult adeninnel, melyik guaninnal, melyik timinnel és melyik citozinnal; ebből pedig összeállítható a vizsgált DNS bázissorendje. A szekvencia-adatokat nemzetközi számítóközpontokban, ún. génbankokban helyezik el. A saját szekvencia gyors komputeres programok segítségével összehasonlítható a génbankban levő ismert szekvenciákkal (Sain és Erdei, 1985).

A Maxam és Gilbert (1977)-féle szekvenálás során a radioaktív végjelölésű egyszálú DNS-mintát négyfelé osztják, és négy roncsolási reakciót végeznek. Ezek során elbomlik a G-, az A- és a G-, a T- és a C-, illetve a C-bázis. A roncsolási reakciót úgy végzik, hogy a reakció részleges, azaz minden lehetséges köztes termék egyidejűleg jelen legyen. A keletkezett fragmentumokat elektroforézissel választják el, és a jelölt részeket autoradiográfiával azonosítják (Sain és Erdei, 1985).

A nukleinsav-szekvencia meghatározásának módszertanát Sambrook et al. (1989) részletesen tárgyalja.