Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Polimeráz láncreakció (pcr)

Polimeráz láncreakció (pcr)

A vizsgálandó nukleinsavmintát a polimeráz láncreakció segítségével in vitro körülmények között szaporíthatjuk fel (amplifikálhatjuk). Ez azért alapvető jelentőségű, mert a vizsgálatokhoz sok esetben nem áll rendelkezésre megfelelő mennyiségű kiindulási anyag, RNS vagy DNS. A szekvencia-specifikus amplifikáció lehetőséget ad arra, hogy igen kis mennyiségben jelenlevő (vírus-)nukleinsavat is kimutathassunk (Saiki et al., 1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A PCR-reakció lényege (90. ábra) az, hogy a denaturált DNS két láncához két ismert szekvenciájú, kb. 20 bázispár hosszúságú primert hibridizálunk, melyek a felszaporítandó szakasz két végét jelölik ki, majd DNS-polimeráz segítségével megtörténik a primerek meghosszabbítása. Ez a reakciósor ciklikusan ismétlődik, újabb és újabb minta-DNS-szekvenciák keletkeznek. A reakció tehát exponenciális lesz, azaz 20–30 ciklus után a célszekvencia 106-szoros mennyiségi növekedése érhető el. Ezért az amplifikációhoz pikogramm (10–12 g) mennyiségű vizsgálati anyag is elegendő lehet. A PCR fő lépései: 1. denaturáció általában 94 °C-on; 2. anel-lálás a primerek olvadási hőmérsékletétől kb. 5 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten (45–60 °C-on); 3. polimerizáció 68 vagy 72 °C-on (Sambrook et al., 1989).

90. ábra - A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A’ és B’: a két oligonukleotid primer. A szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes és Symons, 1991 után]

A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A’ és B’: a két oligonukleotid primer. A szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes és Symons, 1991 után]


A reakció kulcsa a rendkívül hőstabil Taq-polimeráz enzim, amely lehetővé teszi a reakciósor automatizálását. Az amplifikációra gyárilag előállított készüléket használnak, amelyekben a ciklus egyes lépéseinek paraméterei előre programozhatók.

A felszaporított DNS-t általában agarózgélben, etídium-bromidos festés után teszik láthatóvá és hasonlítják össze megfelelő méretmarkerrel, illetve a PCR-termék specifikus azonosítására a Southern-hibridizáció is alkalmazható.

A PCR során keletkező termék kívánság szerint klónozható, illetve közvetlenül szekvenálható is.

Megjegyzés: A PCR-technika nagy előnyei az érzékenység, a fajlagosság és a gyorsaság. Magas fokú érzékenysége miatt speciális laboratóriumi körülmények biztosítását igényli azért, hogy az idegen, nemkívánatos szekvenciák felszaporítása elkerülhető legyen (egyszer használatos eszközök, reagensek ellenőrzése, jól ismert pozitív és negatív kontrollok alkalmazása stb.). A vírusdiagnosztikában azért előnyös a PCR használata, mert rendkívül specifikus, és a mintavételtől számított 4–6 órán belül eredményt ad. A növényvírusok jelentős része RNS-genomot tartalmaz, ezért a polimeráz láncreakciót itt megelőzi egy reverz transzkripciós lépés, amelynek terméke az az első szál komplementer DNS-e lesz, amely az ezt követő PCR templátjául szolgál (91. ábra). A polimeráz láncreakció alkalmazását korlátozó tényező azonban az, hogy az oligonukleotid primerek megtervezéséhez pontos szekvencia-adatokra van szükség.

91. ábra - Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer DNS (cDNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) [McInnes és Symons, 1991 után]

Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer DNS (cDNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) [McInnes és Symons, 1991 után]


A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR)

A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR) a dot-blot hibridizációnál említett összes nukleinsav-kivonással kezdődik. Ezt követi a reverz transzkripció (elsőszál-cDNS-készítés) és a polimeráz láncreakció.

  • Reverz transzkripció

  1. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként, majd helyezzük a mintákat 1 órán át 42 °C-os vízfürdőbe: 2,0 µl nukleinsavoldat (össznukleinsav-kivonásból); 4,4 µl H2O; 2,0 µl 5 × M-MuLV-puffer; 0,1 µl 0,1 M DTT; 0,1 µl RNáz-inhibitor; 1,0 µl 5mM dNTPk; 0,2 µl oligo dT (20 pmol) vagy 3’-vég primer (20 pmol); 0,2 µl M-MuLV Promega (200 u/µl) reverz transzkriptáz.

  2. Egy óra elteltével helyezzük a mintákat jégre, vagy tárolás esetén –20 °C-ra.

    • Polimeráz láncreakció

  3. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként egy-egy 0,5 ml-es Eppendorf-csőbe: 38,7 µl H2O; 2 µl cDNS; 5µl 10 × Taq-puffer; 2µl 5mM dNTPk; 1 µl Primer 1 (100 ng); 1 µl Primer 2 (100 ng); 0,3 µl Taq polimeráz Promega (5 u/µl); 30 µl paraffinolaj. Az olajat csak a végén kell rácseppenteni.

  4. A reakciót egy előre programozott PCR-készülékbe helyezzük, amikor az már a 94 °C-ot elérte.

  5. A reakció befejezése után az olaj alól óvatosan kipipettázzuk az oldatot, és az olajat kloroformos extrakcióval eltávolítjuk.

  6. A mintákból 6–6 µl-t 1%-os agarózgélen elektroforetizálunk.

Ajánlott program egy kb. 1000 bp hosszúságú DNS szakasz kiemelésére, ha a primerek olvadási hőmérséklete kb. 60 °C:

Program

Kezelés

Hőmérséklet

Időtartam

Ciklusszám

a)

denaturálás

94 °C

4 perc

1

b)

denaturálás

annelálás

polimerizálás

94 °C

55 °C

72 °C

1 perc

1 perc

1 perc

35

c)

polimerizálás

72 °C

10 perc

1

d)

tárolás

4 °C

állandó