Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A növényi hormonok meghatározása

A növényi hormonok meghatározása

A növényi hormonok meghatározása azért bonyolult feladat, mert 1. a szövetekben nagyon alacsony (ng) koncentrációkban fordulnak elő, 2. a növények nagy változatossággal termelnek hasonló kémiai szerkezetű molekulákat, amelyek nem rendelkeznek hormonaktivitással, 3. kis molekulatömegűek, kémiai szerkezetük nem nagyon specifikus, 4. az extrakciós és a tisztítási lépések során könnyen bomlanak, 5. a hormonok több csoportja nem egységes (pl. az izopentenil-adenin és a zeatin típusú citokininek két fajtája vagy a C19 és a C20 szénvázú gibberellinek nagy száma ismert), a meghatározásukra használt analitikai módszerek ezért többnyire egy-egy adott kémiai szerkezettel bíró vegyületre irányulnak és nem az azonos biológiai aktivitással rendelkező vegyületcsoport összes tagjára, továbbá 6. a növényen belül az egyes szervek hormontartalma igen eltérő.

A növényi hormonok kvantitatív meghatározásának alapjai

A növényi növekedésszabályozó anyagok meghatározása a biológiai aktivitáson alapuló biotesztekkel, fizikokémiai módszerekkel vagy immunanalitikai módszerekkel történik (Brenner, 1981; Hedden, 1993). A biotesztekre csak az etilén esetében térünk ki. A fizikai-kémiai módszerek lépései a következők: mintavétel, kivonatkészítés v. extrakció, minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás) és mennyiségi analízis.

  • Mintavétel

Vírusfertőzött és egészséges növények összehasonlító vizsgálatakor a mintákat azonos körülmények között nevelt, ugyanolyan élettani állapotú növények megfelelő szervéből és szövetéből kell venni.

  • Kivonatkészítés vagy extrakció

A metanol 80%-os vizes oldata a legelterjedtebb extrahálószer. Lényeges, hogy a kivonás során a vizsgálni kívánt hormonvegyületek ne hidrolizáljanak, más kémiai reakciókban vagy enzimes úton ne károsodjanak. Célszerű nagy tisztaságú kivonószerrel dolgozni, érdemes továbbá egy olyan mintát is készíteni és a többivel azonos módon tisztítani és mérni, amelybe növényi anyagot nem teszünk, csak extrahálószert.

  • Minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás)

Lehetséges lépései a folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás, a szilárd fázisú extrakció, a hagyományos oszlopkromatográfiás, a vékonyréteg-kromatográfiás, a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás és a gázkromatográfiás elválasztás.

A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás a különböző polaritású oldószerekben való eltérő megoszláson alapul. Az oldószer kioldóképességének a megadott körülmények (pH stb.) mellett optimálisnak kell lennie a megfelelő hormonra nézve. A két fázis elválását gátló anyagok (pl. foszfolipidek) rontják a hormonok kioldásának hatékonyságát. A hormonokat kioldó szerves fázis (pl. 1-butanol, etilacetát) tartalmazhat kismértékben vizes puffert, ami az oldószer elpárologtatása során töményebbé válik, és ez szélsőséges pH-viszonyokat eredményezhet. Ezért érdemes a szerves fázist a bepárlás előtt vízzel extrahálni, vagy a pH-ját semlegesíteni.

A szilárd fázisú extrakció lényege, hogy a nyers növényi kivonatot egy kisméretű, eldobható oszlopon tisztítják, aminek töltetén a vizsgálni kívánt anyag, egyéb mintakomponensekkel együtt, megkötődik. A szennyezőkomponenseket azután különféle oldószerekkel eltávolítják az oszlopról, majd egy alkalmas oldószerrel a vizsgálandó mintaalkotót is kinyerik. A módszer előnyei a gyors és egyszerű kivitelezhetőség, a kérdéses mintaösszetevő kedvezően magas kinyerhetősége (kicsi az elválasztási veszteség) és az alacsony oldószerigény. Az oszlop töltete a leggyakrabban szilikagélhez kémiailag kötött oktadecil-szilán (= ODS vagy C18), de kation- és anioncserélő töltetek, valamint egyszerű szilikagél-adszorpciós töltetek használata is elterjedt.

A hagyományos oszlopkromatográfiás elválasztás főként fenolszármazékok és pigmentek eltávolítására alkalmas. Az oszlopok töltete lehet oldhatatlan polivinil-pirrolidon (PVP), Sephadex LH-20, DEAE-cellulóz, továbbá Dowex-50, Duolit és cellulóz-foszfát ioncserélő töltetek, aktív szén, Cellit vagy szilikagél-adszorpciós töltetek.

A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztás mind hatékonyságában, gyorsaságában, mind mintakapacitásában elmarad a nagyhatékonyságú folyadékkromatográf teljesítményétől, alkalmazását gazdasági megfontolások tehetik indokolttá. Növényi hormonok elválasztására cellulóz- és szilikarétegek használatosak.

A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztás (HPLC) az előzetes tisztítási lépéseken átesett növényi minta összetevőit nagy hatékonysággal elválasztó, gyors módszer. Az oszlop töltete fordított fázisú HPLC esetén – aminek alkalmazása igen elterjedt – a legtöbbször oktadecil-szilán (ODS).

A gázkromatográfiás elválasztás (GC) hatékony, gyors kromatográfiás módszer. Korlátozott mintakapacitása miatt többlépéses minta-előkészítési folyamat esetén általában az utolsó kromatográfiás művelet. A hagyományos, töltött gázkromatográfiás kolonnákat a kapilláris oszlopok váltják fel. A növényi hormonok (az etilén kivételével) nem eléggé illékonyak, ezért származékképzéssel alakítják át szerkezetüket, hogy gázkromatográffal elválaszthatóak legyenek. Ilyen származékképző eljárás a metilezés vagy a trimetil-szililezés.

  • Mennyiségi meghatározás

A növényi hormonok kvantitatív meghatározása hatékony elválasztást biztosító kromatográfhoz (HPLC, GC) kapcsolt, megfelelő szelektivitású detektorokkal vagy immunanalitikai módszerekkel (RIA, ELISA) történhet. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográf detektorok két típusa terjedt el növényi hormonok mérésére: a fluoreszcens detektorok és az elektrokémiai detektorok. A fluoreszcens detektorokat elsősorban in-dol-3-ecetsav mérésére használják, mert az indolvegyületek mérésére minden kémiai származékká történő átalakítás nélkül alkalmasak. Az elektrokémiai detektorok oxidatív üzemmódban használva szintén indol-3-ecetsav mérésére alkalmasak, ha az aminocsoport nitrogénmolekulája nem kötött.

A növényi hormonok gázkromatográfiás meghatározása a következő detektorokkal történhet: elektronbefogásos detektor, nitrogén–foszfor detektor és tömegspektrométer. Az első kettő alkalmazása szórványos, a tömegspektrométer használata azonban széles körben elterjedt.

Az elektronbefogásos detektor erősen elektronegatív vegyületekre, tehát halogénezett származékokra és bizonyos aromás molekulákra szelektív detektor. Az abszcisszinsav metil-észterének, illetve más növényi hormonok halogénezett csoportot tartalmazó mesterséges származékainak meghatározására alkalmas. A nitrogén–foszfor detektort nitrogén- vagy foszfortartalmú molekulák szelektív detektálására használják, tehát indol-3-ecetsav- és citokinin-származékok mérésére. A tömegspektrométer a gázkromatográfhoz kapcsolható legnagyobb szelektivitással rendelkező detektortípus. A minta elválasztott komponensei egy ionforrásban ionizált töredékekre hasadnak. Minden vegyület egyedi szerkezetéből adódóan azonos ionizáló energia hatására következetesen ugyanazokra az ionizált töredékekre hasad, és az egyes töredékek képződésének aránya is állandó marad. A berendezés analizátora a töredékeket tömeg/töltés arányuk alapján elválasztja, a detektor pedig érzékeli mennyiségüket, amelyet az ún. tömegspektrumban különböző magasságú függőleges vonalak formájában láthatunk. A töredékek képződése (azonos ionizáló energia mellett) állandó, ezért egy bizonyos komponens tömegspektrum-mintázata (a töredékek egymáshoz viszonyított intenzitása, azaz mennyiségük) is azonos.

  • Immunanalitikai vagy szerológiai módszerek

Kiváló szelektivitásuk mellett megfelelő érzékenységet biztosító módszerek, melyek alacsony tisztaságú növényi minták esetében is alkalmazhatóak. A növényi növekedésszabályozók kis molekulatömegük miatt nem immunogének, ezért nagyméretű fehérjékhez (marha-szérumalbumin vagy tojásfehérje) kötik őket, alkalmassá téve melegvérű állatok (többnyire nyulak) immunizálására. A termelt antiszérum érzékenysége és egyéb vegyületekkel szemben adott keresztreakciója nagymértékben függ az immunizálás során használt hormonfehérje komplex kötésétől. Lényeges feltétel, hogy a fehérjemolekula ne a vizsgálni kívánt hormon valamelyik fő funkcionális csoportjához kötődjék, ami az antitestképződés során epitópként szerepelne. Több vizsgálati módszer ismert.

A radioaktív immunanalitikai módszerek (RIA) közös elve a radioaktív izotóppal jelzett hormonvegyületek és a növényi mintában jelen lévő, azonos típusú hormonmolekulák versengése a specifikus antiszérum-kötőhelyekért. Az elegyben mérhető radioaktív izotóp koncentrációja fordított arányban áll a minta hormontartalmával.

Az enzimhez kötött immunanalitikai módszerek (ELISA) alapja az, hogy a vizsgálatok során a növényi mintában lévő hormonmolekulák peroxidáz vagy alkalikus-foszfatáz enzimhez kötött hormonvegyületekkel versengenek az antiszérum-kötőhelyekért. Az egyensúlyi állapot kialakulását követően az enzim szubsztrátját az elegyhez adva színreakciót kapunk, amelynek intenzitása fordítottan arányos a minta hormontartalmával.

  • Belső standardok használata

A növényi hormonok meghatározását többlépéses minta-előkészítési művelet előzi meg, ami a vizsgálni kívánt vegyületre nézve veszteséggel jár. A folyadék–folyadék megoszlás tökéletlensége, a foszfolipidek vagy a fehérjék általi megkötés, a kémiai átalakulás és az üvegeszközök felületén való megkötődés egyaránt rontja a kinyerhetőség hatékonyságát. A kivonatkészítés során a mintához adott – ismert mennyiségű – standard vegyület koncentrációja azonban az utolsó (analitikai) lépésnél visszamérhető, aminek ismeretében következtethetünk a tisztítási-elválasztási lépcsők együttes kinyerési hatékonyságára és a növényi minta eredeti hormontartalmára. A belső standardot célszerű úgy megválasztani, hogy kémiai szerkezete nagyon közel álljon ahhoz a mintaalkotó vegyülethez (növényi hormonhoz), amit vizsgálni szeretnénk. A hozzáadott belső standard mennyiségének megválasztásakor törekedni kell arra, hogy a mintaelegyben lévő koncentrációja a minta várható hormontartalmával megközelítőleg egyezzen. A leggyakrabban használt belső standardok a 14C vagy 3H radioaktív izotóppal jelzett abszcisszinsav, az indol-3-ecetsav, a G3-gibberellin vagy a zeatin, valamint tömegspektroszkópiás detektálás esetén a 2H és 15N nem radioaktív nehéz izotópokkal egyszeresen vagy többszörösen jelzett hormonvegyületek.

Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározása

Az indol-3-ecetsav kivonása növényi mintákból

Az indol-3-ecetsav (IES) kivonása történhet hagyományos módon, metanol 80%-os vizes oldatával, vagy egyéb IES kivonására alkalmas módszerekkel. Ilyen a növényi minta 65% i-propanolt tartalmazó 0,2 M-os imidazol-pufferben (pH 7,0) történő homogenálása (4 ml kivonószer/g minta arányban). A belső standard hozzáadása után a homogén növényi macerátumot 1 órán át 4 °C-on tartjuk, majd 10 000 g fordulatszámon 5 percig centrifugáljuk, a továbbiakban pedig a felülúszóval dolgozunk (Chen et al., 1988).

Az indol-3-ecetsav elválasztása

  • Folyadék–folyadék megoszláson alapuló elválasztás

Az IES oldékonysága, megoszlása a szerves és vizes fázis között a pH függvényében változik. Semleges vagy lúgos kémhatású közegben a karboxilcsoport protonja disszociál, a molekula negatív töltést hordoz, oldékonysága poláros oldószerekben (pl. desztillált vízben) sokkal jobb. Savas kémhatású közegben azonban a hidrogénion nem disszo-ciál, a molekula töltés nélküli állapotban van, ezért ilyenkor apoláros oldószerekben jobban oldódik. A kivonás során kapott minta IES-tartalmát tehát gyengén lúgos (pH 8,0), 0,1 M-os foszfát-pufferben oldva, etilacetáttal szemben el lehet választani a semleges indolvegyületektől (pl. indol-3-etanol, indol-3-metanol, indol-3-aldehid). Az oldat pH-ját csökkentve (pH 3,0) az IES oldékonysága megváltozik, etilacetáttal kivonható a vizes fázisból. Az IES mellett a szerves oldószer tartalmazza majd az 5-hidroxil-indol-ecetsavat, a 4-klór-indol-ecetsavat, az indol-piroszőlősavat, a fenil-ecetsavat és más savas karakterű indolvegyületeket, míg a konjugált indolvegyületek és az amfoter összetevők (pl. triptofán) a vizes fázisban maradnak. Az etil-acetát helyett dietil-éter is használható, mely még kevésbé poláros oldószer.

  • Hagyományos PVP-oszlopkromatográfia

Oldhatatlan polivinil-pirrolidonnal (PVP) töltött oszlopokat széles körben alkalmaznak IES tisztítására. Az oszlop mérete a minta térfogatától függően igen változatos lehet. Hatásukat alacsony pH mellett a fenolvegyületek visszatartása által fejtik ki, H-kötéseken keresztül. A pH csökkentésével fokozódik az oszlop IES-megkötő képessége, az elválasztás időtartama azonban ezáltal nagyon kitolódik. Kompromisszumként célszerű 4–5 közötti pH-tartományban, citromsav/0,1 M-os Na-foszfát-puffer mozgó fázissal végezni az elválasztást.

  • Az indol-3-ecetsav ioncsere-kromatográfiás elválasztása

A savas karakterű indolvegyületek anioncserélő oszlopokon megköthetőek. A DEAE cellulóz (OH) anioncserélő töltet előkészítése 30 percnyi vízzel való duzzasztással, azután 0,5 M-os H2SO4 oldatos mosással kezdődik. Ezután vízzel mossák, majd 0,5 M-os NaOH-oldatban 10 percig inkubálják. A töltetet ezt követően desztillált vízzel alaposan átmossák, míg a pH-ja tartósan 7,5 alatt nem marad. A nedves DEAE cellulóz ioncserélő anyagot az ismertetett lépések után megfelelő méretű oszlopba töltik (30 g mintából származó növényi kivonat elválasztására egy 100 mm × 20 mm-es oszlop alkalmas), majd rátöltik az IES-t tartalmazó vizes oldatot, és 300 ml vízzel eluálják. Az IES a töltet kationos csoportjain megkötődik, a minta semleges és bázikus összetevői az oszlopról az eluenssel eltávoznak. Az IES és egyéb savas indolszármazékok 200 ml 50 mM-os Na2SO4-oldattal átmosva választhatók le az oszlopról.

DEAE Sephadex A-25 (acetát) anioncserélő oszlopot is használnak IES tisztítására. A gél típusú töltetet vízben duzzasztva készítik elő; 0,5 M-os sósavoldattal, majd 0,5 M-os NaOH-oldattal mossák, azután 1 M-os nátrium-acetát-oldatban inkubálják több órán keresztül. Ezt követően desztillált vízzel mossák mindaddig, amíg pH-ja már nem változik. A töltetet ezután 2-propanol/víz (1:1 térfogatarányú) elegyébe áztatják, és nedvesen oszlopba töltik. Az 50%-os propanolban oldott növényi kivonatot az oszlopra töltik, mozgó fázisként szintén 50%-os propanolt használnak. Az elválasztás után a savas karakterű indolszármazékok oszlopról való leválasztása a 2-propanol/víz mozgó fázishoz adott ecetsavoldattal történhet. Az ecetsav koncentrációja a mozgó fázisban növekedhet lépcsőzetesen, vagy 0 és 10% között gradiens módon. Ez a preparatív célú elválasztás viszonylag rövid, 100–200 mm-es oszlopokon elvégezhető. A szükséges oldószertérfogatok és az egyes indolvegyületek retenciós ideje tapasztalati úton állapítható meg (Momonoki et al., 1983; Nonhebel és Bandurski, 1984).

  • Az indol-3-ecetsav elválasztása szilárd fázisú extrakcióval

A különféle gyári kiszerelésű, egyszer használatos, eldobható oszlopok széles skálája szerezhető be poláros szilikagél- vagy apoláros oktadecil-szilán- (ODS-) töltettel. HPLC- vagy GC-analízis előtt használják őket. Jó hatékonyságuk alapvető feltétele, hogy a következő analitikai lépés elválasztási mechanizmusa eltérjen az itt használt oszlopétól.

Az ODS-oszlopon történő mintatisztítás egyik lehetősége az oszlop aktiválása 2 ml 1%-os ecetsavval, majd a növényi mintát 1% ecetsavat tartalmazó, 5-10%-os metanololdatban viszik az oszlopra. A mintában lévő szennyezőanyagokat a minta oldószerének további részleteivel távolítják el az oszlopról. Az állófázison megkötődött indolvegyületeket azután 1% ecetsavat tartalmazó, lépcsőzetesen növekvő koncentrációjú (max. 70%-os) metanololdat 2–2 ml-es részleteivel eluálják. Szilikagéltöltet esetében 5 ml 0,5 M-os ecetsavval, azután 5 ml 1% ecetsavat tartalmazó, n-hexán/etilacetát (99:1 térfogatarányú) elegyével kezelve tehetik aktívvá az oszlopot. A minta felvitele után az indolszármazékok 1% ecetsavat tartalmazó, hexánban oldott növekvő koncentrációjú (max. 60%-os) etilacetát-oldat 2–2 ml-es részleteivel nyerhetők vissza az oszlopról. Ezek az oszlopok kevesebb mint 1 g töltetet tartalmaznak, ezért mintabefogadó képességük erősen korlátozott.

  • Az indol-3-ecetsav elválasztása HPLC-vel

Fordított fázisú HPLC-rendszerekben az állófázis 5 mm átmérőjű gömb vagy szabálytalan alakú szilikagél hordozószemcsékhez kémiailag kötött szénhidrogénlánc; alkil- (C2, C6, C8, C18) vagy fenilcsoport. Ezek közül az oktadecil-szilán (ODS, ill. C18) terjedt el leginkább a gyakorlatban. Az elválasztás során a mozgó fázis lehet izokratikus (állandó összetételű) és gradiens (az elúció alatt egyre töményebb). Ez utóbbi a csúcselhúzódás kialakulását gátolja. Az eluens valamilyen szerves oldószer, többnyire metanol, etanol vagy acetonitril vízben, illetve vizes pufferben oldva.

Az IES állófázishoz való kötődését a mozgó fázis pH-ja nagymértékben befolyásolja. Mivel savas pH-jú közegben (pH 3,5) az IES karboxilcsoportján lévő hidrogénion nincs disszociált állapotban, tehát a molekula nem hordoz töltést, jobban kötődik az apoláros állófázishoz és lassabban halad át az oszlopon. Az indolvegyületeket ezért rendszerint savas pH-jú mozgó fázissal eluálják. Ezt a módszert ion-visszaszorításnak nevezik. Ha a mozgó fázis pH-ja nem eléggé alacsony, az IES mennyiségének jelentős része ionos állapotba kerül. Ilyenkor a nem-disszociált és disszociált molekulák retenciós ideje nem egyforma, ami csúcselhúzódást okoz.

Az IES meghatározását fordított fázisú HPLC-ionpár változatával is végezhetik. Ennél a módszernél a mozgó fázis pH-ját pufferrel kb. 6,5-re állítják, és hozzáadnak egy lipofil elleniont, pl. tetrabutil-ammonium-ot (TBA+), amelynek töltése ellentétes az elválasztani kívánt molekula töltésével. Semleges pH mellett az IES disszociált állapotban van és a poláros mozgó fázishoz kötődik. A TBA+ ellenion jelenlétében azonban IES–TBA+ ionpárok alakulnak ki, amelyek eltérő polaritásuk miatt inkább az apoláros ODS állófázishoz kötődnek, ezáltal az oszlop IES-visszatartó képessége nagymértékben megnő.

  • Az indol-3-ecetsav gázkromatográfiás elválasztása

A gázkromatográfiás elválasztást megelőző lépés a származékképzés. Az IES éterben diazometánnal metilezhető. A diazometán sárga, erősen mérgező, robbanékony gáz! Éteres oldata N-metilén-N-nitrozo-p-toluénszulfonamidból Schlenk és Gellerman (1960) módszerével, a Cohen (1984) által kifejlesztett egyszerű berendezéssel állítható elő. A mintát teljesen megszárítják, azután metanolban feloldják, majd az éteres diazometánból annyit adnak hozzá, amennyi az oldatot tartósan sárgára színezi. A származékképzés ideje alatt az éter mennyisége legalább ötszöröse kell, hogy legyen a metanol mennyiségének. A reakció igen rövid idő alatt végbemegy, tehát 5 perc múlva a reagenst nitrogéngáz átáramoltatása közben eltávolítják.

Az indolvegyületek másik gyakori származékképzési típusa a trimetil-szililezés (TMS), ami többféleképpen végezhető, ezek közül Badenoch-Jones et al. (1982) módszerét ismertetjük. A száraz mintát kevés metanolban feloldották, majd üvegfiolába töltötték, amelyben szárazra párolták. Ezután diklór-metánt adva a mintához azeotropos bepárlással szárították tovább. A származékképző lépésben az előkészített száraz anyagot 30 μl acetonitril/BSTFA (bisz-trimetilszilil-trifluoracetamid) (1:1 térfogatarányú) elegyében feloldották, a fiolát lezárták, és 70 °C-on tartották 10 percig. A mintát ezután közvetlenül vizsgálhatták gázkromatográffal, vagy nitrogén átáramoltatása mellett megszárították és apoláros oldószerben (hexán, etilacetát) feloldották. A TMS-származékképzés legfőbb nehézségét a mintában nyomnyi mennyiségben jelenlévő víz okozza. Ez gátolja a származék képződését, valamint elősegíti a szililezett termék bomlását. A TMS-származékokat ezért nem lehet HPLC-vel tovább tisztítani.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Az indolvegyületek gázkromatográfiás elválasztása két különböző típusú megosztó fázison történhet; a gyakorlatilag apoláros dimetil-szilikon alapú SE-30, OV-101 és DB-1 nedvesítő folyadékokon, valamint a kissé polárosabb OV-7, OV-17, DC-550 és SP-2250 folyadékfázisokon, amelyek fenil-metil-szilikon és dimetil-szilikon keverékén alapulnak. Mindkét nedvesítőfolyadék-típus alkalmas szinte az összes indolszármazék vizsgálatára. Nagy csúcskapacitásuk (a kromatográfia során elválasztható komponensek nagyobb száma) és nagy érzékenységük miatt a kapilláris kolonnák egyre inkább tért hódítanak az indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározása terén.

Az IES gázkromatográfiás elválasztására példaként egy Dunlap és Binzel (1996) által közölt módszert ismertetünk. A megtisztított növényi mintából 2 μl mennyiséget automatikus, megosztás nélküli (splitless) módszerrel egy 10 m-es, 0,18 mm belső átmérőjű kapilláris oszlopba injektáltak. Az oszlop belső felületét 0,4 μm vastagságú DB-1701 nedvesítőfolyadék-film borította. Az elválasztást 1 ml/perc hélium vivőgáz térfogati sebesség mellett, 70 kPa oszlopnyomással végezték. Az elválasztás alatt az oszlop hőmérsékleti programja a következő volt: 0,5 percig 65 °C, majd 15 °C/perc ütemben az értékét 225 °C-ra emelték, amit 3 percig tartottak, azután 250 °C-ra emelve a hőmérsékletet 5 percig tartották ezt az értéket. Az elválasztás összesen mintegy 20 percet vett igénybe, az IES retenciós ideje ilyen körülmények mellett 11 perc volt.

Az indol-3-ecetsav kvantitatív meghatározása

  • Az indol-3-ecetsav meghatározása HPLC-vel

Az IES meghatározása HPLC-vel különböző detektorok (fluoreszcens és elektrokémiai detektorok) segítségével történhet. A két detektortípus közül a fluoriméterek IES-sel szemben mutatott érzékenysége a jobb (Sandberg et al., 1987).

A különféle növényi szövetekben az egyes indolvegyületek mennyisége nagymértékben eltérhet. Nagy különbségek lehetnek az egyéb összetevők koncentrációjában is, amelyektől az elválasztás során meg kell tisztítani a mintát. Egy új növényi szövet IES-tartalmának meghatározásakor ezért célszerű a tisztítási lépések több kombinációjának kipróbálása, majd egy HPLC-vel való elválasztás és detektálás után a kérdéses csúcsokhoz tartozó komponensek felfogása és más független HPLC-módszerrel történő újraelválasztása és mérése.

Az előkészített növényi minta IES-tartalmát a HPLC-vel történő elválasztás után határozzuk meg, ún. belső standard hígulási módszerrel. A belső standard radioaktív izotóp atomot tartalmaz, amely vagy az indolváz ötödik szénatomján lévő trícium (3H) izotóp, vagy a karboxi-metil csoport első vagy második szénatomját helyettesítő 14C radioaktív izotóp lehet. Először ismert mennyiségű tiszta belső standardot analizálunk HPLC-vel. A detektor által képzett csúcsot kalibrációs görbéhez hasonlítjuk, a csúcshoz tartozó belső standard IES-t összegyűjtjük, és folyadékszcintillációs számlálóval megmérjük az oldat radioaktív sugárzásának mértékét. A következő lépésben az extrahált növényi mintához ismert mennyiségű belső standardot adunk. Az előző fejezetekben leírt módszereket alkalmazva a mintát tisztítjuk, HPLC-vel elválasztjuk, az IES-t detektáljuk, végül ennek is mérjük a radioaktív sugárzását, mely kisebb lesz, mint a tiszta belső standardban mért érték. Azért lesz ez az érték kisebb, mert a minta természetes IES-tartalma és a sugárzó belső standardként hozzáadott indol-3-ecetsav a HPLC-oszlopon nem válik el egymástól, közös csúcsot képez, mely összegyűjtve, a nem sugárzó, természetes IES-tartalom miatt, alacsonyabb egységnyi IES-re jutó radioaktív tevékenységet mutat. A növényi kivonat eredeti, endogén IES-tartalma a következő képlettel számítható ki (Sandberg et al., 1987):

Y = [(Ci /Cf) – 1]X

amelyben

Y: a növényi kivonat IES-tartalma (ng),

X: a mintához adott belső standard mennyisége (ng),

Ci: a tiszta belső standardban mért radioaktív sugárzás (dpm/ng); dpm: percenkénti hasadások száma (= disintegrations per minute),

Cf: a minta természetes IES-tartalmával hígított belső standard radioaktív sugárzása (dpm/ng).

  • Az indol-3-ecetsav meghatározása gázkromatográfhoz kapcsolt tömegspektrométerrel (GC-MS)

A GC-MS hatékony és elterjedten használt eszköz indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározására. A kapilláris GC-kolonnák közvetlenül kapcsolhatók tömegspektrométerhez, a töltött kolonnákból kiáramló gázt azonban előzőleg egy gázelválasztón kell keresztülvezetni, ami a vivőgázt (rendszerint héliumot) eltávolítja a mintából. Az IES-t és származékait leggyakrabban elektronütköztetéssel ionizálják, 70 eV ionizációs potenciál energiaszinten. Ilyen ionizáló energia hatására a bázision következetesen a 130 m/z értékkel rendelkező kvinolínium-ion lesz, mely az oldallánc lehasadásával képződik. A legtöbb szerves molekula ionizálásához szükséges energiamennyiség mindössze 10 eV (kb. 1000 kJ/mol). Ezen az energiaszinten pozitív molekulaionok keletkeznek. Ennél nagyobb ionizáló energia következtében a molekula különféle hasadásokat szenved. A gyakorlatban elterjedt 70 eV hatására a különböző indolvegyületekből a töredékek széles skálája képződik, amely jellemző az eredeti molekula szerkezetére. Maga az eredeti molekula azonban ilyen magas ionizációs energiaszinten a töredékképződés miatt gyakran nem is jelenik meg a tömegspektrumban. Ezért olyan tömegspektroszkópiás vizsgálatokban, amelyekben a molekulaion detektálása is szükséges (pl. egy ismeretlen vegyület molekulatömegének meghatározása), kíméletesebb ionizációs módszert kell alkalmaznunk. Ez lehet pozitív vagy negatív kémiai ionizáció, mely érzékenyebb az elektronütköztetéses ionizációs eljárásnál. Indolszármazékok kémiai ionizálása pozitív töltésű metánionokkal vagy negatív töltést hordozó ammóniaionokkal 5–10-szer erősebb ionintenzitást eredményez, mint az elektronütköztetéses módszer (Rivier és Saugy, 1986). A 21. táblázat az IES és származékai tömegspektrumában megjelenő molekula- és bázisionokat, valamint jellemző töredékeiket tartalmazza.

21. táblázat - Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában előforduló jellegzetes ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil, Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision.

Elektronütköztetéses ionizáció (70 eV)

IES és származékai

A tömegspektrum jellegzetes ioncsúcsai

Irodalom

IES

Mi+ 175 (36), 131 (12), Bi+ 130 (100), 103 (11), 77 (13).

Vebrel et al. (1983)

IES

Mi+ 175 (33), 131 (12), Bi+ 130 (100), 103 (12), 77 (17).

Wurst et al. (1984)

IES

Mi+ 175 (63), 131 (25), Bi+ 130 (100), 103 (19), 77 (26).

Feung et al. (1975)

Me IES

Mi+ 189 (30), 131 (12), Bi+ 130 (100), 103 (9), 77 (13).

Vebrel et al. (1983)

Me-TMS IES

Mi+ 261 (28), Bi+ 202 (100), 200 (5), 170 (2), 145 (3), 130 (4).

Sandberg et al. (1987)

di-TMS IES

Mi+ 319 (47), Bi+ 202 (100), 130 (9), 129 (6), 75 (12), 73 (38).

McDougall és Hillman (1980)

Pozitív kémiai ionizáció

IES származékai

Reagens gáz

A tömegspektrum jellegzetes ioncsúcsai

Irodalom

Me IES

amónia

208 (7), 207 (61), 191 (13), Mi+(Bi+) 190 (100), 130 (10).

Rivier és Saugy (1986)

Me IES

metán

218 (11), Mi+ 190 (84), 189 (20), 158 (18), Bi+130 (100).

Rivier és Saugy (1986)

Me IES

i-bután

228 (3), 191 (12), Mi+(Bi+) 190 (100), 189 (8), 130 (5).

Rivier és Saugy (1986)

di-TMS IES

ammónia

393 (4), 392 (16), 323 (7), 322 (25), Mi+(Bi+) 321 (100)

Rivier és Saugy (1986)

di-TMS IES

metán

348 (17), Mi+(Bi+) 320 (100), 304 (15), 230 (1), 202 (3).

Badenoch-Jones et al. (1984)

Negatív kémiai ionizáció

IES származékai

Reagens gáz

A tömegspektrum jellegzetes ioncsúcsai

Irodalom

Me IES

ammónia

189 (15), Mi(Bi) 188 (100), 175 (3), 174 (1), 161 (29).

Rivier és Saugy (1986)

Me IES

metán

Mi(Bi) 188 (100).

Rivier és Saugy (1986)

Me IES

i-bután

194 (60), Mi(Bi) 188 (100), 178 (48), 162 (50), 150 (67).

Rivier és Saugy (1986)

di-TMS IES

ammónia

389 (12), Mi(Bi) 319 (100), 299 (11), 289 (9), 213 (8).

Rivier és Saugy (1986)


A gibberellinek meghatározása

A gibberellinek meghatározásakor a fő nehézséget az jelenti, hogy a növényekben nagyon sok gibbánvázas vegyület fordul elő, amelyek egymástól csak kis szerkezeti eltéréseket mutatnak, a szövetekben lévő összes koncentrációjuk mégis igen alacsony. A gibberellinek többségének molekulaszerkezetére az erősen oxidált funkcionális csoportok nagy száma jellemző, ami stabilitásukat lényegesen csökkenti. Ezért tisztításuk és elválasztásuk során célszerű a 2,5–8,5 pH tartományon belül maradni és vizes oldatban 40 °C alatti hőmérsékleten dolgozni. A gibberellintartalmú növényi kivonatok és a különböző tisztítási lépéseken átesett minták mélyhűtőben lefagyasztva, –20 °C-on tárolhatók.

A gibberellinek kivonása növényi mintákból

A különböző növényi szervek és szövetek gibberellintartalma nagy különbségeket mutathat. A termésekben lévő magok gibberellintartalma például 1000-szerese is lehet a vegetatív részek hormontartalmának, amit a gibberellinek tisztítása során figyelembe kell venni.

A gibberellinek kivonását leggyakrabban tiszta hideg metanollal vagy metanol 80%-os vizes oldatával végzik. Egységnyi tömegű növényi mintát 4–5-szörös térfogatú kivonószerrel homogenálnak, majd 4 °C-on több órán át állni hagynak. A folyadék és szilárd fázist ezután szűréssel szétválasztják és a szilárd növényi maradékot újra extrahálják. A két extrahálószer-részletet egyesítik, a metanolt azután vákuumban 40 °C alatti hőmérsékleten bepárolják.

A gibberellinek tisztítása

  • Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló tisztítás

Az extrakciót követő bepárlás maradékát, a gibberellint tartalmazó vizes fázist 0,1 M-os foszfátpufferben oldják. A pH értékét 2,5-re kell beállítani. Az első oldószeres kirázási lépésben a vizes fázissal megegyező térfogatú etil-acetáttal háromszor kirázzák a gibberellintartalmú oldatot, ami a legtöbb gibberellin típusú molekulát átoldja a szerves fázisba ezen a pH értéken. A következő lépésben gyengén lúgos (pH 8,5) foszfátpuffer egyenlő térfogatú egységeivel ismét háromszor rázzák ki a szerves gibberellintartalmú oldatot, ez a lúgos pH miatt disszociációra készteti a gibberellineket, ami poláros jelleget kölcsönöz a molekuláknak, tehát poláros-vizes fázisba viszi a gibberellinsavakat. A vizes gibberellinoldat pH-ját ezután ismét 2,5-re állítják, és etil-acetát egyenlő térfogatú mennyiségeivel újra szerves fázisba viszik a gibberellineket. Végül a szerves fázisban nyomokban előforduló foszforsav eltávolítása érdekében 2,5-ös pH-érték mellett, négyszer 5 térfogat% vízzel mossák a gibberellint tartalmazó etilacetát-fázist, mert az elkövetkező bepárlás során az oldatban maradt foszforsav betöményedik és szélsőséges pH-viszonyokat eredményez.

  • Fenolok eltávolítása polivinil-pirrolidonnal

A folyadék–folyadék-megoszlásos módszerrel nyert gibberellintartalmú oldatot leggyakrabban szennyező vegyületek a zsírsavak, a fenolok és a cukrok. A fenolok (főleg pigmentek) stabil komplexet képeznek a gibberellinekkel. A polivinil-pirrolidon (PVP) azonban jó hatékonysággal köti meg a fenolokat, ezért hormonok tisztítása során gyakran használják. Az etil-acetátban oldott, majd bepárolt frakciót 0,1 M-os foszfátpufferben (pH 8,5) feloldják, azután egy 0,5–1,0 g PVP-vel töltött rövid oszlopra töltik. Az elúciót az oszloptérfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű oldószerrel (foszfát-pufferrel) végzik. A fenolok kötődése fokozható a töltet savanyú (pH 3,0) pufferrel való előmosásával.

  • A gibberellinek tisztítása szilárd fázisú extrakcióval

A gibberellintartalmú növényi kivonatok kis mennyiségeinek gyors és jó minőségű elválasztása valósítható meg egyszer használatos, eldobható oktadecil-szilán (fordított fázisú) oszlopokon. Az oszlop előkészítését 5 ml metanollal, majd 5 ml 5%-os ecetsavval mosva (fecskendővel injektálva) végzik. A növényi kivonatot 0,1 M-os foszfát-pufferben (pH 2,5) juttatják az oszlopra, ezt is injektálva. A rendszert ezután 5 ml 5%-os ecetsavval, majd 5 ml desztillált vízzel mossák. A gibberellineket végül 80%-os metanollal viszik ismét oldatba és távolítják el az oszlopról.

  • A gibberellinek tisztítása anioncsere-kromatográfiával

Anioncserélő oszlopon (DEAE-Sephadex A-25, Dowex 1X1-100) a gibberellinek csoportja hasonló saverősségük miatt egyöntetűen elválasztható. Az egyik lehetőség a 0,2 M-os ecetsav-metanol 1:1 térfogatarányú elegyében feloldott növényi mintát acetát típusú Sephadex anioncserélő oszlopra vinni, az oszlopot az oldószer azonos térfogatú mennyiségeivel négyszer mosni, majd a gibberellineket 2 térfogategységnyi 2 M-os ecetsav/metanol 1:1 arányú elegyével eluálni (Crozier és Durley, 1983). A másik bevált módszer a Dowex 1X1-100 anioncserélő gyantával töltött oszlopon való elválasztás (Browning és Saunders, 1977). A vizes növényi kivonatot (pH 8,0) az oszlopra viszik, amit azután vízzel mosnak, végül etanol/1M-os hangyasav (4:1 térfogatarányú) elegyével eluálják a gibberellineket. Az anioncsere-kromatográfiát követő szilárd fázisú extrakció (ODS-oszlopon) két lépésben jobb megoldás, mint a folyadék–folyadék-megoszláson alapuló kirázás.

A gibberellinek elválasztása

A gibberellineket tisztításuk során hasonló szerkezetük miatt egy csoportként kezeltük, elválasztásukkor azonban az egyes gibberellinvegyületeket különválasztjuk egymástól.

  • Vékonyréteg-kromatográfia

A kereskedelmi forgalomban kapható kész szilikagélrétegek, pontosan beállított oldószerek használata mellett, megfelelnek a gibberellinek elválasztására (MacMillen és Suter, 1963). Felbontóképességükben és a szétválasztott gibberellinek visszanyerhetősége tekintetében azonban elmaradnak a HPLC-től. A szilikagélrétegen való elválasztás rendszerint savas kémhatású oldószerben (ecetsav- vagy hangyasavoldatban) történik, ami biztosítja a gibberellineken lévő karboxilcsoport protonált állapotát. Ezáltal javul a gibberellinek mobilitása és a komponensek élesebb sávban válnak el egymástól. A gibberellinek etil-acetát telített vizes oldatával vagy acetonnal eluálhatók a rétegről.

  • A gibberellinek elválasztása HPLC-vel

A HPLC a mintaösszetevők elválasztásának igen jó hatékonysága mellett, a retenciós értékek pontos megismételhetőségében és az elválasztás kis időigényében is felülmúlja az egyéb kromatográfiás módszereket. Az oszlop töltete rendszerint 5–10 μm nagyságú szabálytalan vagy gömb alakú szilikagél hordozószemcsékből áll, amelyhez valamilyen funkciós csoportot kötnek állófázisként. A funkciós csoport lehet poláros karakterű (normál fázisú HPLC), vagy egy hosszabb, apoláros szénhidrogénlánc (fordított fázisú HPLC). A minta a mozgó fázisban feloldva jut az oszlopra, 40 MPa körüli magas nyomáson, amit egy pumpa biztosít. A preparatív célra használt HPLC-oszlopok általában 5–10 mm belső átmérőjűek, de nagy mennyiségű mintákhoz nagyobb méretű kolonnák is szóba jöhetnek.

A mozgó fázis rendszerint metanol vagy etanol vizes oldata, amely kis mennyiségben (kb. 50 μl/l) tartalmaz valamilyen savat (foszforsavat, ecetsavat vagy hangyasavat), biztosítva a gibberellinek protonált állapotát. Jensen et al. (1986) a gibberellinek széles skáláját választották el, és mérték a retenciós idejüket egy 250 x 4,6 mm belső átmérőjű 5 μm szemcseméretű Supercosil LC18 fordított fázisú HPLC-oszlopon. A mozgó fázis 1 ml/perc folyadékáramlási sebességű izokratikus metanololdat volt, kémhatását foszforsavval állították be (pH 3,0).

  • A gibberellinek gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: A gibbánvázon lévő karboxilcsoport(ok) diazometánnal metil-észterré alakítható(k). A diazometánnal veszélyessége miatt csak elszívófülke alatt lehet dolgozni. A metilezésre szánt mintát metanolban oldják, majd az éteres diazometán-oldatot cseppenként adagolva végbemegy a metileződés folyamata. A reagenscseppek hozzáadását akkor hagyják abba, amikor az elegyből nem szabadul már fel további nitrogén, és az oldat megtartja sárga színét. A felesleges diazometán néhány perc elteltével eltávolítható az oldat szárazra párlásával nitrogén alatt. Nagy mintamennyiség esetén a felesleges diazometán ecetsavval elbontható és az oldat szárazra párolható. A metil-észterré alakított gibberellinek kevésbé polárosak, mint a szabad gibberellinsavak, ezért a nem metileződött frakció eltávolítható, ha a kivonatot valamilyen viszonylag apoláros oldószerben (pl. diklórmetánban) feloldjuk, majd egy tiszta üvegcsébe töltjük. A minta ebben a formában is használható gázkromatográfiás elválasztásra, de a gyakorlatban többnyire még egy származékképző lépést beillesztenek, trimetil-szilil-éterré alakítva a hidroxilcsoportot tartalmazó gibberellineket. Ez a lépés a gibberellin-metil-észterek polaritását tovább csökkenti, valamint a tömegspektrométer által képzett spektrumban javítja a molekulacsúcsok intenzitását. A trimetil-szililezésre használt két leggyakoribb reagens a BSTFA (bisz-trimetil-szilil-trifluoracetamid) és az MSTFA (N-metil-O-trimetil-szilil-trifluoracetamid). A növényi mintakivonat kis mennyiségeit üvegcsébe töltik és nitrogén alatt vagy deszikkátorban alaposan szárazra párolják. Ez azért elengedhetetlenül szükséges, mivel mind a reagensek, mind a kész trimetil-szilil-származékok nedvesség hatására bomlanak. Az üvegcsék lezárása után a reakcióelegyek hőmérsékletét 90 °C-ra emelik, és ezen tartják 30 percig. A BSTFA és az MSTFA egyaránt illékony vegyületek, ezért a GC-kolonnán jól elválnak a meghatározni kívánt gibberellinektől, de vákuum alatt deszikkátorban is elpárologtathatók és más illékony, nedvességnyomoktól mentes oldószerrel helyettesíthetők.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A gibberellinek elválasztására leginkább a kvarc kapilláris oszlopok felelnek meg. Hedden (1987) metil-TMS gibberellinszármazékokat analizált kapilláris kolonnán (25 m × 0,2 mm i.d.), ami kb. 0,3 μm vastagságú BP-1 – kémiailag kötött – apoláros megosztó fázissal volt bevonva. A kolonna az injektálást követő 1 percig 60 °C-os volt, majd 240 °C-ig 20 °C/perc, 300 °C-ig 4 °C/perc intenzitással emelték a hőmérsékletet. A hélium-vivőgáz nyomása 90 kPa volt. Az ilyen típusú oszlop mintakapacitása erősen korlátozott (kb. 0,1 μg). A gibberellinek gázkromatográfiás analízisére a hagyományos GC-detektorok nem alkalmasak, tömegspektroszkópiás detektálásuk terjedt el.

A gibberellinek mennyiségi meghatározása

  • A gibberellinek GC-MS analízise

A gibberellinek GC-MS mennyiségi vizsgálatát többszörös ionmegfigyeléssel (multiple ion monitoring; MIM) végzik, amelyben a tömegspektrométer a teljes spektrum felvétele helyett csak néhány, az adott vegyületre nagyon jellemző töredékion intenzitását méri. Két mintában lévő azonos gibberellinvegyület relatív mennyisége a molekulacsúcsok abszolút értékeinek összehasonlításával kapható meg, ha azonban a molekulacsúcs intenzitása nagyon kicsi, az összehasonlítás valamelyik jellegzetes töredékion értéke alapján is elvégezhető. A gibberellinek extrakciós, tisztítási és elválasztási veszteségeit belső standardok felhasználásával lehet korrigálni, amit rögtön a szövet eldörzsölése után kell a mintához adni. Célszerű olyan standard vegyületet választani, ami kémiailag nagyon hasonló a vizsgált gibberellinmolekulához. A tömegspektrométer a részecskéket tömegük alapján választja szét, ezért GC-MS vizsgálathoz használhatunk (nem radioaktív) nehéz izotóppal jelzett gibberellin-analógokat, amik a növényben lévő gibberellin molekuláktól mindössze annyiban különböznek, hogy vázukban egy, illetve néhány H-, C- vagy O-atomot 2H-, 13C- vagy 18O-izotóp helyettesít. Megbízható eredményt kalibrációs görbe segítségével kaphatunk. Ennek lényege az, hogy a belső standardként használt szintetikus gibberellin-analóg vegyületből és magából a vizsgált gibberellinhormonból olyan oldatsorozatot készítenek, amelynek tagjai a két komponenst különböző arányban tartalmazzák. (Például 0,0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 mól gibberellin/mól belső standard gibberellin-analóg sorrendben.) Az oldatsor tagjait ezután tömegspektrométerrel analizálják, megkapva így az egyes mólarányokhoz tartozó csúcsintenzitás-arányokat, majd az értéksorhoz görbét illesztenek. A belső standardot tartalmazó minták mérése során kapott csúcsintenzitás-arány alapján a kalibrációs görbe segítségével meghatározható a minta gibberellin/belső standard gibberellin-analóg mólaránya, amiből a kérdéses gibberellin fiziológiás mennyisége kiszámítható, mert a hozzáadott belső standard mennyisége általunk választott, ismert érték.

  • A gibberellinek kvantitatív szerológiai meghatározása

A növényekben található gibberellinek széles skálája miatt szerológiai meghatározásuk nagy körültekintést igényel. A vizsgálathoz használt antiszérum szelektivitása alapvető fontosságú. Atzorn és Weiler (1983) a gibberellinek (G3, G4 és G7) rendkívül érzékeny mennyiségi meghatározására alkalmas (0,2–0,5 pg küszöbértékű!) kompetitív ELISA-módszert fejlesztettek ki. A liofilezett antiszérumokat 50 mM NaHCO3-t tartalmazó oldatba (pH 9,3) vitték, a G3-ra specifikus IgG-antiszérumot 10 mg/l hígításban, a G4 és G7-re specifikus IgG-t pedig 25 mg/l hígításban alkalmazták. A mikrotálca üregeibe 0,2 ml antiszérumoldatot mértek, majd 3 napon keresztül, 4 °C-on inkubálták. Az IgG-oldatot ezután leöntötték, az üreg falához nem kötődött IgG-molekulák maradékát háromszori desztillált vizes mosással távolították el, az így érzékenyített mikrotálcákat legalább két hétig lehetett tárolni 4 °C-on. Az érzékenyített üregekbe a következőkben bemérték a kompetíciós elegyet, ami 50 μl TBS- (Tris-buffered saline) puffert [50 mM 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propándiol (=Tris), 1 mM MgCl2, 0,01 M NaCl, pH 7,5], 100 μl standard gibberellinoldatot vagy megfelelően hígított növényi extraktumot és 50 μl TBS-pufferben oldott gibberellin-alkalikus-foszfatáz konjugátumot tartalmazott. A kompetíciós elegyben vetélkedés folyt az alkalikus-foszfatáz jelzőenzimhez kötött gibberellinmolekulák és a mintában, ill. a standard oldatban található gibberellinek között az IgG-kötőhelyekért. Amennyivel magasabb volt a növényi mintában a kérdéses gibberellinvegyületek (G3, valamint G4 és G7) szintje, annyival több kötődött belőlük az üreg falán található specifikus helyekre, visszaszorítva az alkalikus-foszfatázzal jelölt gibberellinmolekulák megtapadását. Az ELISA-tálcákat ezután 16 órán át 4 °C-on inkubálták, majd a folyadékot leöntötték és a lapokat desztillált vízzel ismét háromszor mosták. Az utolsó lépésben a jelzőenzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot – üregenként 0,2 ml oldatot – mértek az egyes reakcióterekbe (1 mg/ml szubsztrát 50 mM-os NaHCO3 oldatban, pH 9,6). A mikrotálcákat ezt követően 6 órán át 37 °C-on tartották, míg az enzim által katalizált színreakció – ami sárga színt eredményez – ki nem fejlődött. Az üregekben lévő folyadék színintenzitása arányos a reakcióterek falához kötött alkalikus-foszfatáz-gibberellin konjugátum mennyiségével és fordítottan arányos a növényi minta, ill. standard oldat gibberellintartalmával. A reakciót 50 μl 5 M-os KOH-oldattal állították le, abszorbanciáját (A: 405 nm) ELISA-mikrotálcák mérésére használt spektrofotométerrel állapították meg. A gibberellin standard hígítási sorának abszorbanciaértékei alapján kalibrációs görbe szerkeszthető, ami lehetővé teszi a növényi minták gibberellintartalmának meghatározását.

A citokininek meghatározása

A citokininek kivonása növényi mintákból

A citokininek extrakciójának hagyományos módszere szerint a növényi mintát 80%-os hideg metanolban homogenálják, majd a citokinineket tartalmazó oldószert bepárolják. Ez a kivonási módszer azonban magas foszfatáz-aktivitással jár együtt, ezért a citokinin-nukleotidok nagy része elbomlik. Bieleski (1964) extrakciós módszerével a növényi foszfatázok aktivitása gátolható: a mintát folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, majd metanol/kloroform/90%-os hangyasav/desztillált víz (12:5:1:2 térfogatarányú) elegyében 18 órán keresztül –15 °C-on tartjuk. A kivonószert többrétegű gézen leszűrjük, és a növényi szövetet hideg metanol/90%-os hangyasav/desztillált víz (6:1:4) elegyében homogenáljuk, azután –15 °C-on, 4 órán át tároljuk. A felülúszót többrétegű gézen, majd szűrőpapíron leszűrjük és egyesítjük az előző extrakciós lépés kivonószer-elegyével. A minta kezdeti folyékony nitrogénben való megfagyasztása fontos része a kivonási módszernek.

A citokininek elválasztása

  • Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás

A bázikus citokininek (szabad bázisok, ribozidok és glükozidok) 1-butanollal kirázva a szerves fázisba oldódnak át, miközben a citokinin-nukleotidok a vizes fázisban maradnak. A pH-t 7,0 és 8,2 közötti értékre kell beállítani, hogy a bázisok a kevésbé poláris protonált állapotban legyenek. Lehetséges, hogy 1-butanol esetében az első kirázás alkalmával a két fázis nem válik el rögtön, akár egy éjszakát is igénybe vehet a szerves és vizes fázis kialakulása.

  • A citokininek ioncsere-kromatográfiás elválasztása

Kationcserélő oszlopon a bázikus citokininek eredményesen tisztíthatók. A vizes növényi kivonatok pH-ját ecetsavval beállítjuk (pH 3,0), majd azonos pH-jú NH4+ típusú cellulóz-foszfát-oszlopon tisztítjuk. Az oszlopot pH 3,0-ra beállított ecetsavoldattal mossuk, amely a citokinin-nukleotidokat eltávolítja az oszlopról. A következő lépésben a pozitív töltésű molekulákat (így a bázikus citokinineket is) 2 M-os ammónium-hidroxid-oldattal választjuk le az oszlopról.

  • A citokininek elválasztása HPLC-vel

Számos kvantitatív vizsgálati módszer előtt (tömegspektrometria, immunanalitikai mérések stb.) jó hatékonysággal alkalmazható, nagy mintakapacitással rendelkező citokinintisztítási eljárás. Az oktadecil-szilán- (ODS) töltetek elterjedése nagymértékben hozzájárult a HPLC-citokininek elválasztása terén elért sikeréhez. A citokininek preparatív célú elválasztására egy 150 × 10 mm i.d., fordított fázisú HPLC-oszlop, 1 ml injektálható mintakapacitással jól megfelel. Mozgó fázisként 5 ml/perc áramlási sebességű acetonitril (7–11%-os) egyenletesen növekvő koncentrációjú, gradiens oldata vált be, előzetesen TEAB-bal (trietil-ammónium-hidrogénkarbonát) a pH-ját semlegesre állítva.

  • A citokininek gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: A bisz-(trimetil-szilil)acetamid (BTMSA) kétszeres mennyiségű acetonitrilben feloldva 60 °C-on, 5 perc alatt trimetil-szilil (TMS)-származékká alakítja a vizsgált citokinineket (izopentenil-adenin, zeatin, izopentenil-adenin-ribozid, zeatin-ribozid). Elterjedtebb azonban a bisz-(trimetil-szilil)trifluoracetamid (BSTFA) származékképző reagens alkalmazása. Számos oldószerben (piridin, dimetil-formamid, acetonitril) feloldva használják, szobahőmérséklettől 120 °C-ig, 30 perc reakcióidő-tartamtól több óráig, a reakciókörülmények széles skáláját alkalmazva. A TMS-származékképzés legfőbb hátránya, hogy az egyes citokininek gyakran többféle származékot is képeznek a reakció során – pl. a zeatin kétszeresen és háromszorosan, a zeatin-ribozid négyszeresen és ötszörösen szubsztituált származékok képzésére is hajlamos –, a reakció körülményeitől függően. Úgy tűnik, hogy a szobahőmérsékleten (néhány órán keresztül) végzett TMS-származékképzés és a minta gondos kiszárítása (hogy vizet még nyomokban se tartalmazzon) következetesen a legkevésbé szubsztituált származék képződését eredményezi.

A permetil-citokinin-származékok képzése jóllehet bonyolultabb, mint a TMS-származékoké, mégis számos előnyük van azokkal szemben: nem bomlékonyak, ezért HPLC-vel vagy más elválasztási módszerrel tovább tisztíthatók, és nem képeznek többféle szubsztituált származékot. A permetilezés folyamata során a citokinineket egy erős bázissal, azután metil-jodiddal reagáltatjuk. A bázisok közül a metil-szulfinil anion vált be, melyet kálium-t-butoxid és száraz dimetil-szulfoxid reakciójával állítunk elő. A kálium-t-butoxid hozzáadása után az elegyet nitrogén alatt 10 percig kevertetjük, majd centrifugálással tisztítjuk. A szulfinil-anion-koncentrációt sósavval titrálva – fenolftalein indikátor jelenlétében – határozzuk meg. A gyakorlatban leginkább bevált aniontartalom kb. 0,1 M, amihez 20 mg kálium-t-butoxid szükséges 1ml dimetil-szulfoxidban feloldva. A néhány μg tisztított és szárazra bepárolt mintát 50 μl metil-szulfinil aniont tartalmazó reagenssel visszük ismét oldatba. Ezután 10 μl metil-jodidot adunk az oldathoz, szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, majd 50 μl desztillált vízzel hígítjuk, végül a permetilezett citokinineket átoldjuk 100 μl kloroformba. A mintát nitrogéngáz átáramoltatása mellett szárazra pároljuk, szükség esetén vákuumdeszikkátor alatt tovább szárítjuk.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A citokinin-származékok gázkromatográfiás elválasztására apoláros, magas hőmérsékleten is stabil megosztó fázissal rendelkező oszlopokkal dolgoznak (pl. SE-30, SE-52, OV-1, OV-17). A tapasztalatok szerint egy 1,5 m × 4 mm i.d., 100–120 mesh szemcseméretű, 3%-os OV-1 nedvesítőfolyadék-filmmel bevont Gas Chrom Q hagyományos töltött kolonna jól bevált. Az elválasztás hatékonysága tovább fokozható, ha kapilláris kolonnát használunk (pl. SGE 25QC2/BP 10–0,25), amelynek mérete 25 m × 0,2 mm i.d.. Ez az oszloptípus kiválóan bontja fel a TMS és a permetilezett citokinin-származékokat. Használatakor az ajánlott felső hőmérsékleti határ: 270 °C. A citokinin-származékok elválasztásának mindennapi gyakorlatához jól megfelel egy rövidebb, szélesebb kapilláris kolonna is (12 m × 0,3 mm i.d.), nagyobb hőstabilitású nedvesítő folyadékkal párosítva (SGE BP-1 vagy BP-5). Ez a kolonna a citokininek gyorsabb elválasztását teszi lehetővé, és felbontóképessége is még elég jó. Az oszlop 80 kPa héliumvivőgáz-nyomás mellett működtethető, de nagy molekulasúlyú anyagok gyorsabb elválasztására a nyomást, legfeljebb 200 kPa-ig, emelni lehet (Horgan és Scott, 1987).

A citokininek mennyiségi meghatározása

  • A citokininek GC-MS analízise

A gázkromatográffal elválasztott különféle citokininek (citokinin-származékok) a tömegspektrométer ionizációs kamrájában töredékekké (fragmentumokká) alakulnak. A különböző citokininek azonos körülmények között végzett ionizáció hatására, egyedi molekulaszerkezetüknek megfelelően, következetesen ugyanazokra az ionizált töredékek-re hasadnak, az egyes töredékek képződésének arányát is megőrizve. Tehát egy adott szerkezetű citokinin-molekula azonos ionizáló energia hatására megismételhető módon ugyanazt a tömegspektrumot adja.

Az elválasztott vegyületek ionizálását többnyire gáz halmazállapotban, elektronok-kal ütköztetve végzik. Változtatva az ütköző elektronok energiáját, különböző energiamennyiséget közölhetünk a vizsgálandó molekulákkal, aminek következtében azok hasadásokat szenvednek (különféle töredékeket képezve). Az ionizálás további lehetősége a kémiai ionizáció, ami kíméletesebb az elektronütköztetésnél. Citokininek kémiai ionizálására leginkább megfelelő reagens ion az NH4+, amely csak fokozatosan veszít energiájából a minta molekuláival való sokszoros ütközés során. Így nem a minta egyetlen molekulája veszi fel a teljes energiamennyiséget, ezért a vizsgált molekulák kevésbé töredeznek.

A tömegspektrumot koordináta-rendszerben ábrázolva a vízszintes tengelyen szerepel az ionizált molekula, illetve a molekulatöredékek tömegének és töltésének hányadosa (m/z érték). Rendszerint egyszeres töltéssel rendelkező ionok keletkeznek, ezért a különböző molekula- és molekulatöredék-ionok m/z értékét csak a tömegük befolyásolja. A függőleges tengelyen az ionizált részecskék előfordulásának egymáshoz viszonyított relatív gyakoriságát, intenzitását ábrázoljuk (0 és 100% között). Így egy citokinin-vegyület tömegspektrumát tekintve (97. ábra) az egymást követő függőleges vonalak az egyes töredékekre vonatkoznak – növekvő részecsketömegüknek megfelelő sorrendben elhelyezkedve –, a vonalak magassága pedig az ionizált töredékek egymáshoz viszonyított relatív mennyiségét jelöli. A vízszintes tengelyen az origótól legtávolabbra eső vonal az eredeti molekula ionizációjával képződő (tehát hasadást nem szenvedő) molekulaiont ábrázolja, amelynek tömege egyenlő a minta nem ionizált molekulájának tömegével. Azt az iont (töredéket), amely a fragmentumok között a legnagyobb mennyiségben van jelen, tehát amely a legintenzívebb (legmagasabb) spektrumvonalat mutatja, bázisionnak nevezzük, és a függőleges tengelyen feltüntetett skála alapján ezt jelöljük 100%-kal. Az összes többi fragmentum mennyiségét ehhez viszonyítjuk.

97. ábra - A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a legjellegzetesebb fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I. = relatív intenzitás; m/z = tömeg/töltés arány

A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a legjellegzetesebb fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I. = relatív intenzitás; m/z = tömeg/töltés arány


Egy adott citokinin (pl. zeatin) különböző mintákban vizsgálva azonos ionizáló energia hatására ugyanazt a spektrumot hozza létre. Két minta zeatinkoncentráció különbségét a bázision vagy más megfelelő töredékion abszolút intenzitásának összehasonlításával kaphatjuk meg. Mivel elvileg minden ion abszolút intenzitása arányos a mintában jelen lévő vegyület mennyiségével, ezért az ismert m/z érték alapján akár mindössze egy töredékion (vagy a molekulaion) mérésével is meghatározhatjuk a vizsgálni kívánt hormonvegyület koncentrációját (tehát nincs szükség teljes tömegspektrumra). Ezt a módszert szelektív ionmegfigyelésnek (selective ion monitoring; SIM) nevezzük. Különösen kisebb tömegű töredékek esetében előfordulhat azonban, hogy egyéb – szennyező anyagból származó – azonos tömegű töredékion jelenléte torzítja (látszólagosan növeli) a kiválasztott ion intenzitását, és ez egyéb fragmentumok vizsgálata hiányában rejtve marad. Ezért SIM-vizsgálatkor igyekeznek minél nagyobb tömegű és minél egyedibb (csak az adott citokininre jellemző) töredéket kiválasztani. Ez a hibaforrás kiküszöbölhető úgy, hogy egyszerre több jellemző töredékion intenzitását mérik (multiple ion monitoring; MIM), így a normális hasadási aránytól esetleg eltérő, relatív töredékion-intenzitásra rögtön fény derül.

Akár teljes tömegspektrumot vizsgálunk, akár SIM- vagy MIM-módszerrel dolgozunk, a mintában egy adott citokinin tényleges koncentrációját kalibrációs görbe segítségével állapíthatjuk meg. Célravezetőbb azonban, ha a tisztítási műveletek megkezdése előtt ismert mennyiségű hormon-analóg vegyületet, belső standardot mérünk a mintához. Erre a célra 2H vagy 15N izotóppal egyszeresen vagy többszörösen jelzett citokinin-vegyületeket használnak. A meghatározás utolsó lépésében – a tömegspektroszkópiás detektálás során – a tömegspektrométer analizátora, az izotópatomok nagyobb tömege miatt, elválasztja egymástól a mintában természetesen jelenlévő citokinin-vegyületből származó töredékeket és az izotóppal jelzett belső standard töredékeit. A tömegspektrumban így számos fragmentumnak megtalálható lesz az izotóppal jelzett párja. Egy töredéknek és izotóppal jelzett párjának a relatív intenzitáskülönbsége alapján – a bemért belső standard ismert koncentrációja miatt – kiszámíthatjuk a minta fiziológiás hormontartalmát, kiküszöbölve a minta-előkészítés során bekövetkező veszteségeket is! A leggyakrabban használt belső standardok az N6 oldallánc első szénatomján két 2H-atomot vagy a két terminális szénatomon öt 2H-atomot hordozó deutériummal jelzett, illetve a purin váz négy nitrogénatomját 15N izotóppal helyettesítve kapott szintetikus citokininek. A SIM-módszer nyilvánvalóan nem alkalmas arra, hogy egyszerre vizsgáljuk egy természetes citokinin-vegyület töredékének és izotóppal jelzett analógjának mint belső standardnak az intenzitását.

A trimetil-szilil- és permetilszármazékok képzése nem befolyásolja a belső standardok alkalmazását. Az izotópos belső standardok használata során két tényezővel számolnunk kell, amelyek zavarhatják a tömegspektrométerrel való mennyiségi meghatározást. Egyrészt a növényi minta természetes citokinin-vegyületei is tartalmazhatnak izotópatomokat, amelyek a tömegspektrumban látszólagos növekedést okozhatnak a belső standard intenzitásában. Célszerű ezért minél több izotópatomot tartalmazó hormon-analógot választani, tehát például két 2H helyett inkább öt 2H-t tartalmazó szintetikus citokinineket használni, mert ezek tömege több egységgel haladja meg a nehéz izotópot nem tartalmazó, illetve egy-két nehézizotóp-atomot tartalmazó természetes citokininek tömegét, tehát a spektrumban jobban elkülöníthetőek.

Hasonló problémát okoz az is, ha a belső standardként használt, jelzett vegyületünk számottevő mennyiségben tartalmaz izotóppal nem jelzett hormonmolekulákat, amelyek a tömegspektrometriás vizsgálat során nem választhatók el a mintában jelen lévő (meghatározni kívánt) citokininektől. A belső standard kiváló minősége tehát alapvető feltétele a megbízható kvantitatív vizsgálati eredményeknek.

A citokininek és származékaik elektronütköztetéssel nyert fontosabb töredékeit a 22. táblázat tartalmazza (Horgan és Scott, 1987).

22. táblázat - Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses tömegspektrumát alkotó fontosabb ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-adenin, [9R]iP = izopentenil-adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil, perMe = permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision.

Citokinin vagy citokinin-származék típusa

A tömegspektrumban megjelenő jellegzetes ioncsúcsok

iP

Mi+ 203 (54), 188 (65), 161 (13), 160 (96), 148 (17), 136 (15),

Bi+ 135 (100), 119 (22), 108 (33), 93 (10), 84 (18).

[9R]iP

Mi+ 335 (22), 203 (60), 202 (22), 188 (51), 161 (12), 160 (80), 148 (23),

136 (27), Bi+ 135 (100), 119 (21), 108 (27).

Z

Mi+ 219 (20), Bi+ 202 (100), 201 (41), 188 (75), 186 (28), 160 (50),

136 (53), 135 (37), 120 (25), 119 (39), 108 (32).

[9R]Z

Mi+ 351 (8), 201 (95), 200 (61), 199 (86), 198 (50), 188 (53), 160 (60),

148 (40), 136 (60), Bi+ 135 (100), 119 (46).

di-TMS iP

Mi+ 347 (24), 332 (38), 305 (22), 304 (83), 274 (20), 264 (30), 247 (22),

207 (30), 192 (15), 160 (14), 135 (15).

tri-TMS [9R]iP

Mi+ 551 (13), 245 (21), 232 (51), 230 (25), 217 (24), 204 (10), 203 (27),

202 (25), 188 (10), 160 (15), 147 (15), 103 (30).

di-TMS Z

Mi+ 363 (6), 348 (15), 274 (39), 273 (51), 272 (26), 260 (70), 258 (17),

232 (28), 192 (21), 188 (17), 156 (36).

tri-TMS Z

Mi+ 435 (6), 420 (14), 347 (20), 346 (72), 332 (27), 306 (11), 305 (16),

304 (61), 272 (15), 264 (19), 156 (11).

tetra-TMS [9R]Z

Mi+ 639 (3), 536 (17), 320 (16), 245 (14), 230 (16), 217 (18), 201 (30),

188 (24), 156 (32), 147 (13), 103 (29).

di-perMe iP

Mi+ 231 (70), 216 (57), Bi+ 188 (100), 176 (16), 163 (18), 162 (34),

135 (21), 134 (38), 133 (30), 107 (25), 98 (26).

tetra-perMe [9R]iP

Mi+(Bi+) 391 (100), 348 (20), 218 (28), 217 (76), 216 (83), 202 (80),

175(32), 174 (95), 148 (30), 101 (29), 98 (25).

tri-perMe Z

Mi+ 261 (7), Bi+ 230 (100), 216 (6), 188 (22), 176 (4), 162 (7), 134 (8),

107 (7), 67 (7), 42 (11), 41 (10).

penta-perMe [9R]Z

Mi+ 421 (6), 390 (71), 348 (6), Bi+ 216 (100), 174 (17), 148 (6), 101 (11),

71 (10), 67 (8), 45 (45), 41 (17).


  • A citokininek kvantitatív szerológiai meghatározása

Vonk et al. (1986) nőszirom szöveteiben mérték kompetitív, indirekt ELISA-módszerrel a Z, a [9R]Z, az iP és a [9R]iP koncentrációját. A növényi kivonatot anioncsere-kromatográfiával, majd szilárd fázisú extrakcióval (oktadecil-szilán oszlopon) tisztították. A szabad citokinin-bázisokat (Z, iP) HPLC-vel választották el a ribozidszármazékoktól ([9R]Z, [9R]iP). Az elválasztást követően a frakciókat bepárolták, majd PBS-Tween-pufferrel ismét oldatba vitték a komponenseket, ezt használva az ELISA-vizsgálatokhoz [PBS-Tween-puffer (Phosphate-buffered saline + Tween): 0,01 M-os foszfát puffer, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20; pH 7,4]. A 96-lyukú ELISA-mikrotálca érzékenyítését üregenként 200 μl [9R]Z- és [9R]iP- KHLH-konjugátumoldattal végezték [KHLH (keyhole limpet hemocyanin) = egy tengeri kagylóból származó fehérje], aminek töménysége 20 μg/ml coating puffer volt. (Coating puffer: 0,05 M Na2CO3/NaHCO3; pH 9,6). Az érzékenyített lemezeket hűtőszekrényben, 4 °C-on, egy éjszakán keresztül inkubálták. Felhasználás előtt a lapokat egyszer desztillált vízzel, ötször PBS-Tween-pufferrel mosták. A különböző hígításban elkészített mintákat és a citokinin-standardokat PBS-Tween-ben oldva mérték az üregekbe (100 μl). Azután a [9R]Z-vel és a [9R]iP-vel szemben termelt antiszérumot PBS-Tween-ben megfelelően hígítva hozzáadták az üregekhez (100 μl). Az így elkészített kompetíciós elegyben a növényi anyagból származó citokininek és az érzékenyítéssel az üregek falához kötött citokinin-konjugátumok vetélkednek egymással az elegyhez adott antiszérum-kötőhelyekért. Az immunkomplexek kialakulása egy éjszakát igényel, 4 °C-on inkubálva az ELISA-tálcákat. Ezután a lemezeket PBS-Tween-nel ötször mosták, amivel eltávolították a lemez falához nem kötődött antigén-antitest komplexeket. Az ELISA-rendszer antitestkötő kapacitásának felső határát (B0) olyan üregek beállításával vizsgálták, amelyek nem tartalmaztak mintát, csak antiszérumot és PBS-Tween-t, tehát nem jött létre kompetíció. Az antitestkötő képesség alsó határát (Bu) olyan kompetíciós elegyben határozták meg, ami a nem kötött antigént (Z, iP, stb.) nagy túlsúlyban tartalmazta, gyakorlatilag megakadályozva ezzel, hogy az antitestek az üreg falához kötődjenek. A következő lépésben alkalikus-foszfatáz jelzőenzimmel konjugáltatott, nyúl-IgG-re specifikus antiszérumot adtak az üregekhez PBS-Tween-ben oldva (200 μl; 1500 ×-os hígításban), amely hozzákötődött az üregekben maradt, citokininekre specifikus nyúl-IgG- (antitest-) molekulákhoz. A tálcákat 3 órán át, 35 °C-on inkubálták, PBS-Tween-nel ötször mosták, végül szubsztrát-pufferben oldva (coating puffer + 0,5 mM MgCl2) az üregekhez mérték az enzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot (200 μl; 1 mg/ml). A tálcákat 35 °C-on inkubálva a szubsztrátból színes termék képződött az alkalikus-foszfatáz katalitikus hatására. A színintenzitást 405 nm-en mérték ELISA-lapok leolvasására kifejlesztett spektrofotométerrel. A kalibrációs görbét a következő képlet segítségével szerkesztették meg:

amelyben

B: az üreg falához kötődött antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,

B0: a bemért antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,

AB: a standardot (ill. mintát) tartalmazó üregben mért extinkció-érték,

ABu: a minimális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték,

AB0: a maximális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték.

A B/B0 értékeket egy koordináta-rendszer y-tengelyén vették fel (0–100%), aminek x-tengelyén az egyes B/B0 értékekhez tartozó Z, iP, [9R]Z és [9R]iP értékeket ábrázolták (pmol, pg). Az ismeretlen citokinintartalmú minta extinkcióját ismerve a B/B0-t kiszámították, és a szigmoid kalibrációs görbével egybevetve leolvasták a minta hormontartalmát.

Az etilén meghatározása

Az etilén biológiai aktivitását ismereteink szerint 0,1–10 nl/ml koncentrációtartományban fejti ki, ezért analitikai meghatározása során legalább 0,01 nl/ml érzékenységű módszerrel célszerű dolgoznunk. Az etilén gáz halmazállapotú, ezért növényi szövetből történő kivonása lényegesen egyszerűbb, mint a többi növényi növekedésszabályzóé: a szövetekből vett gázminta vagy a szövetek által kibocsátott gáz felfogva közvetlenül vizsgálható. A vizsgálati eredmények értékelésekor azonban figyelembe kell vennünk azt, hogy a növényi szövetek különböző mértékben megkötik a termelődő etilén egy részét. Ez a pufferhatás főként a gyors etilénkoncentráció-változások mérését zavarja.

Etilén-mintavételi módszerek

  • Mintavétel növényi szövetekből

Olyan növényi mintákból, melyek belső üregeket, gáztereket tartalmaznak (pl. almatermések, paprikabogyó), fecskendőre illesztett injekciós tűvel közvetlenül vehetünk gázmintát. A mintavétel ideje alatt a vizsgálni kívánt növényi részt tarthatjuk folyadék alatt, vagy a mintavevő tűt bevonhatjuk zsírral, nehogy a minta külső légköri gázokkal szennyeződjön. A gázmintát óvatosan vegyük a fecskendővel, mert a hirtelen nyomáscsökkenés szintén külső gázok bejutását okozhatja a mintavételi térbe. Ez a módszer ismételt mintavételre nem alkalmas.

A különböző termések és gumók által termelt etilént vákuummal is kivonhatjuk. Olaj- vagy vízlégszivattyúra köthető deszikkátort 2/3-ig feltöltünk vízzel vagy telített sóoldattal (amely gátolja a minta által kibocsátott, valamint egyéb, levegőből származó gázok oldódását). Egy felfordított tölcsért vagy a tetején nyitott harangot a folyadékba süllyesztünk, ügyelve arra, hogy a tölcsér csúcsa is a folyadékréteg színe alatt legyen, de alul ne tapadjon a deszikkátor fenekéhez (esetleg súlyokkal rögzíthetjük). A harang, illetve tölcsér belső felülete buborékmentes kell, hogy legyen. A tölcsér nyakába belül vízszintesen egy rácsot erősítünk, amely a folyadék felhajtóerejével szemben leszorítja a mintát, megakadályozva, hogy az, alulról nekinyomódva a tölcsér szárának, elzárja a gázok útját. Végül a mintát behelyezzük a harang alá, amelynek tetejét, illetve tölcsér esetében a tölcsér szárának végét gumimembránnal lezárjuk, és vákuumot hozunk létre az edényben. A szövetekből kiszabaduló gázok a tölcsér szárának csúcsában gyűlnek össze. Rövid idő múlva a szivattyút leállítjuk, az edényt felnyitjuk, és a gumimembránon keresztül fecskendővel gázmintát veszünk. A minta a kivonás során folyadékba merül, ezért légzése, etiléntermelése fokozódik, tehát a kibocsátott gázok összetétele változik. A felsoroltak miatt a lehető legrövidebb ideig és a legkisebb vákuummal dolgozzunk. Tekintettel kell arra is lennünk, hogy túl erős vákuum esetén a folyadékban oldott gázok felszabadulnak, keveredve a minta által termelt gázeleggyel, ami teljesen eltorzíthatja a mintavétel eredményét.

  • Mintavétel a növény által kibocsátott gázokból

Ezek a módszerek alkalmasak a teljes növény etiléntermelésének a mérésére is. A mintavétel típusa és az általa nyert adat információtartalma alapján a módszerek két fajtáját különböztetjük meg: a statikus és a dinamikus módszereket. A statikus módszerek esetében a meghatározás egy adott időtartam alatt kibocsátott gázok összes mennyiségéből történik. A folyamatos módszerek esetében a növényi mintát tartalmazó gáztéren folyamatosan ismert összetételű gázkeverék vagy levegő áramlik át. Mind a bemenő, mind a kimenő gázkeverékből mintát veszünk, és etiléntartalmukat összehasonlítjuk.

Statikus módszerek: Előnyük, hogy felépítésük és működtetésük egyszerű, rövid időtartamú mérésekre, alacsony mintaszám mellett, jól alkalmazhatóak. A teljes növényt vagy a növény egy eltávolított részét légmentesen lezárható tárolóedénybe helyezzük. Az edény tartalmazhat akár levegőt, akár egy általunk beállított, ismert gázkeveréket. Az edény lezárása után mintát veszünk a gáztérből, ezt az időpontot tekintjük a vizsgálat kezdetének. A vizsgálat végén ismét mintát veszünk a gáztérből. A termelt etilén menynyiségét a következő képlettel számítjuk ki:

amelyben

A: a gáztér kezdeti és végső etilénkoncentrációjának a különbsége (nl),

B: a bemért növényi anyag (g),

C: a vizsgálat ideje (h).

A növényi anyag által termelt etilén mennyiségének kiszámításához ismernünk kell a méréshez használt edény térfogatát. Kisméretű edényeket vízzel megtöltve mérhetjük tömegnövekedésüket. Nagyobb tartályok esetében ismert térfogatú gázt befecskendezve és koncentrációját visszamérve, a hígulás mértéke alapján meghatározhatjuk térfogatukat. A gáztér valódi térfogatát jobban közelíthetjük azonban, ha figyelembe vesszük a minta által kitöltött teret, számolva azzal is, hogy a növényi szövetek szintén tartalmaznak gáztereket. A legtöbb friss növényminta 1 g-ja mintegy 1 ml szilárd-folyékony fázist tartalmaz (a többi gáz) (Saltveit és Yang, 1987). Pontosabb eredményt kapunk tehát, ha 1 g növényi mintát 1 ml térfogattal számítunk, és az így kapott térfogatértéket levonjuk az edény térfogatából.

Dinamikus (átáramló rendszerű) módszerek: Felépítésük és működtetésük bonyolultabb a statikus módszereknél, de hosszú távú vizsgálatok esetében, sorozatos mintavétel mellett szükséges az alkalmazásuk. A dinamikus berendezésekre általában jellemző, hogy az etilénvizsgálatra szánt növényt vagy növényrészt tartalmazó zárt edényen ismert összetételű gázkeverék áramlik át, ismert mennyiségben. A berendezés alapvető része a gázkeverő cső, amelynek bevezető csonkjaihoz kapcsolódnak a különböző gáztartályok (levegő, N2, O2, CO2, C2H2). Minden csonkba beépítenek két szelepet, az egyik a beáramló gázok mennyiségének pontos beállítására, a másik az adott gáz áramlásának gyors megszakítására való, a beállított értékek megőrzése mellett. A beállított gázkeverék teljes átáramló mennyiségét is mérik. A vizsgálati eredményeket befolyásoló szennyező gázok (etilén, széndioxid) eltávolítására gáztisztítókat építenek be a rendszerbe. A levágott növényrészek vagy szövetdarabok kiszáradását a rendszerbe iktatott gáznedvesítő küszöböli ki. Dinamikus módszerek esetében a termelt etilén mennyiségét a következő képlet segítségével számíthatjuk ki:

amelyben

A: az átáramló gáz mennyisége (ml/h),

B: a bemenő és kimenő gázkeverék etilénkoncentrációjának különbsége (nl/ml),

C: a bemért növényi anyag mennyisége (g).

A fenti egyenlet azonban csak akkor érvényes, ha a növényminta etiléntermelése egyenletesen állandó és a rendszerünk egyensúlyi állapotban van. Az egyensúlyi állapot kialakulásának időigénye a tárolóedény térfogatától és a gázáram sebességétől függ. A rendszer állapotát (egyenletes etiléntermelés mellett) akkor tekinthetjük egyensúlyinak, ha az edény össztérfogatának a háromszorosát kitevő gázmennyiség áramlott már át rajta (ilyenkor a bemenő gázkeverék és a növény által kibocsátott gáz keveredése tökéletes). Amennyiben a növényminta etiléntermelése gyorsan változik, értékének kiszámítása nem egyensúlyi rendszerekre kidolgozott matematikai módszerekkel történhet (Marynick és Marynick, 1975).

Az etilén mennyiségi meghatározása

  • Biotesztek

Bizonyos növényfajok igen érzékenyek a levegő etiléntartalmára: adott etilénkoncentráció hatására jellegzetes tüneteket mutatnak. Sötétben nevelt borsó-csíranövények (7 napos korban) 0,1–1,0 nl/ml levegő-etiléntartalom mellett szárrövidülést, szárvastagodást, a szár meggörbülését és vízszintes növekedést mutatnak (Knight et al., 1910). A tünetek magasabb etilénkoncentráció mellett kifejezettebbé válnak. Fiatal (5–6) leveles paradicsomnövények 0,1 nl/ml etilénkoncentráció hatására levélhervadást és levélhullást mutatnak.

Ismeretlen összetételű gázminta etiléntartalmát biotesztek segítségével úgy becsülhetjük meg, ha a gázmintába helyezett tesztnövények reakcióját összehasonlítjuk olyan növények tüneteivel, amelyeket előzetesen standard etiléntartalmú gázsorozatban tartottunk.

  • Az etilén gázkromatográfiás meghatározása

A gázkromatográfia messze a legelterjedtebb módszer az etilén mérésére. Az oszlop töltete lehet egyszerű, szilárd Al-oxid vagy Porapak, illetve gáz-folyadék kromatográfia esetében szinte bármilyen nedvesítő folyadék – Chromosorb, Porapak vagy egyéb szilárd hordozószemcse-felületen. Az etilén elválasztására megfelel egy 0,5 m × 3,0 mm i.d. rézkolonna, 40–60 mesh szemcseméretű Al-oxid töltettel. Az oszlop 30–80 °C hőmérsékleten, 20 ml/perc nitrogén vivőgáz térfogati sebesség mellett működtethető. Gyakran szükséges lehet az oszlop egy éjszakán keresztül történő hevítése 150–180 °C körüli hőmérsékleten, alacsony intenzitású vivőgáz-átáramoltatás mellett, így fokozva az oszlop hatékonyságát. Ez a lépés megismételhető, ha az oszlop szennyezetté válik, és az etilén már nem megfelelően válik el más gázoktól (például az etántól). Kvarc kapilláris oszlop (15 m × 0,2 mm i.d.), apoláros szilikonolaj típusú nedvesítő folyadékkal (pl. SE-30) párosítva szintén jól használható etilén meghatározására. Ezen az oszlopon az etilén retenciós ideje 0–10 °C között mintegy 4,5 perc; ilyen körülmények között más gázoktól jól elválasztható csúcsot ad. A kolonnán elválasztott etilén detektálására három detektortípus terjedt el: a lángionizációs, a fényionizációs és a félvezető detektor.

Az abszcisszinsav meghatározása

Az abszcisszinsav kivonása növényi mintákból

Az abszcisszinsav (ABS) kivonása friss növényi anyagból vagy folyékony nitrogénben mélyhűtött, majd –20 °C-on tárolt növényi mintából egyaránt elvégezhető. Egy vizsgálathoz kb. 5–10 g anyagra van szükség. Legelterjedtebb extrahálószerei a 80%-os metanol, vagy a 80% acetont és 20% 0,1 M-os ecetsavat tartalmazó oldószerelegy, de más szerves oldószerek, így etanol, etil-acetát, kloroform, hangyasav, illetve ezek különböző arányú keverékei is használhatók (egységnyi tömegű növényi anyaghoz 5–10 térfogategységnyi oldószert adva). Antioxidáns vegyület jelenléte javítja a kivonatkészítés hatékonyságát. A növényi szövet oldószeres extrakcióját porcelánmozsárban eldörzsölve vagy géppel homogenálva végzik, majd a felülúszót centrifugálással választják el a szilárd szövetmaradványoktól. A kivonatot a következő tisztítási lépés előtt (folyadék–folyadék-megoszlásos, ill. kromatográfiás elválasztás) a vizes fázis térfogatára vagy teljesen szárazra párolják.

Az abszcisszinsav elválasztása

  • Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás

Az ABS gyenge sav. Savas közegben, pH 3,0 alatt disszociálatlan állapotban van, és apoláros oldószerekben (pl. éter) nagyságrendekkel jobban oldódik, mint vízben. Lúgos kémhatású közegben (pH 9,0) viszont disszociációja csaknem teljes, vízben való oldékonysága ekkor sokkal jobb, mint szerves oldószerekben. Ezek ismeretében tehát lúgos közegben (pH 8,0) éterrel rázatva a vizes növényi extraktumot, megtisztíthatjuk a mintát a bázikus és semleges – éterben oldódó – komponensektől, miközben az ABS a vizes fázisban marad. Ha az oldat kémhatását ezután megváltoztatjuk (pH 3,0), éterrel szerves fázisba vihetjük az ABS-t, egyéb éterben oldódó szerves savakkal együtt (ilyenkor az erősen poláros komponensek a vizes fázisban maradnak).

  • Hagyományos oszlopkromatográfia és szilárd fázisú extrakció

A legelterjedtebb – ABS elválasztására használt – oszlopkromatográfiás töltet a polivinil-pirrolidon (PVP), amely jó hatékonysággal köti meg a mintában lévő fenolvegyületeket, és az ABS kevés veszteséggel nyerhető vissza az elúció végén. A mintát legtöbbször közel semleges (pH 6,0) foszfát-pufferrel nyerik vissza az oszlopról.

Az ABS-tartalmú növényi kivonat szilárd fázisú extrakciója különféle gyári kiszerelésű (Sep-Pak, Waters Associates stb.) előre töltött, egyszer használatos oszlopokkal végezhető. Leggyakoribb a fordított fázisú, oktadecil-szilán töltet alkalmazása. Az elúció metanol és ecetsav, vagy metanol és foszforsav keverékével történhet.

  • Az abszcisszinsav vékonyréteg-kromatográfiás elválasztása

A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztási lépés eredményeként az ABS az éteres fázisba kerül, amelyet szárazra párolva egy, még viszonylag heterogén kivonatot nyernek, amit vékonyrétegen, vagy HPLC-vel tisztíthatnak tovább. Vékonyréteg esetében a száraz extraktumot kb. 100 μl metanolban feloldják, és ezt viszik fel a rétegre. Az ABS vékonyréteg-kromatográfiás elválasztására fluoreszcens indikátort tartalmazó, 0,5 mm vastag szilikagélrétegek terjedtek el. Az ABS foltja a vékonyrétegen elnyeli az UV-sugárzást, így UV-fény alatt kimutatható. A vékonyréteget használat előtt célszerű metanol/ecetsav (98:2 térfogatarányú) elegyével mosni a szennyeződések eltávolítása érdekében. A rétegre a minták mellett tiszta abszcisszinsav markert is el kell helyezni, gondosan ügyelve arra, nehogy a minták valamelyikével érintkezzen. Mintafelvitel előtt érdemes az egyes sávokat tűvel megkarcolva elválasztani. A futtatáshoz több oldószerkombináció használható: toluol/etil-acetát/ecetsav (különböző arányú elegyei), kloroform/ecetsav (98:2) vagy kloroform/metanol/víz (75:22:3). Kifejlesztés után az abszcisszinsav markerrel egy magasságban futó foltokat 1–2 ml etil-acetát telített vizes oldatával, vagy aceton/metanol (1:1) elegyével eluálják a rétegről. Az eluátumból a szilikagélszemcséket centrifugálással vagy szűréssel távolítják el.

  • Az abszcisszinsav elválasztása HPLC-vel

A folyadék–folyadék-megoszlásos elválasztással, illetve a szilárd fázisú extrakcióval nyert, félig tisztított növényi mintát szárazra párolják, majd 1 ml 20% metanol/80% 0,1 M-os ecetsav elegyében feloldják, ezt injektálják a HPLC-oszlopra. A HPLC-oszlopok közül a fordított fázisú oktadecil-szilán (ODS) töltetű oszlopok használata gyakori eleme az ABS-elválasztásnak. Nagyméretű (150 x 10 mm i.d.), tipikus szemipreparatív ODS-oszlopra 100 mg éteres kivonat (Horgan, 1981), illetve 5 g friss növényi anyagból készített tisztítatlan extraktum injektálható (Neill és Horgan, 1987). Kisebb, analitikai célra használt oszlopok (150 × 4,5 mm i.d.) mintakapacitása jóval kevesebb, de felhasználási területük is alapvetően más: részben már megtisztított növényi minták további szétválasztására alkalmasak. Ez utóbbi oszloptípusra vonatkoznak a következő konkrét elválasztási paraméterek (Neill és Horgan, 1987): a gradiens-elúciót 0,1 M-os ecetsavban oldott metanollal végezték (0–100% között, lineárisan növekvő koncentrációban), 30 percen keresztül, 2 ml/perc eluensáramlási sebesség mellett. Ebben az esetben az abszcisszinsav retenciós ideje 10–13 perc között változott.

  • Az abszcisszinsav gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: Az ABS metil-észterének előállításához szükséges diazometánt Schlenk és Gellerman (1960) módszerével állítják elő. A diazometán nemcsak robbanékony, de rákkeltő is, előállítását és a metilezés folyamatát elszívófülke alatt kell végezni! A diazometánból kis mennyiséget (max. 20 ml-t) fejlesztve, felfogják éter/metanol (4:1 térfogatarányú) elegyében, és így, oldott állapotban tárolják –20 °C-on tárolják. A metilezésre szánt száraz mintához kevés, (kb. 1 ml) diazometán-oldatot adnak, amelyben a mintát mintegy 10 percig hagyják állni. Ha a diazometán sárga színe hamar eltűnik, akkor további reagens hozzáadása szükséges.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Apoláros és poláros megosztó fázisú oszloptöltetek egyaránt elterjedtek metilezett ABS GC-analízisére. Apoláros nedvesítő folyadékok például a metil-szilikon OV-1, SE-30, DC-200 vagy SP-2100. Poláros megosztó fázisként az Epon-1001, az XE-60, az Ultrabond-PEGS és a Carbowaxok használata javasolható. Neill és Horgan (1987) az abszcisszinsav és két metabolitjának gázkromatográfiás elválasztását egy 1 m × 4 mm i.d. töltött kolonnán végezték, 3% OV-1 megosztó fázissal, 210 °C oszlophőmérsékleten. A nitrogén vivőgáz térfogati sebessége 40 ml/perc volt. Az oszlopból távozó komponensek mennyiségét elektronbefogásos detektorral mérték. A hagyományos töltött kolonnák mellett kvarc kapilláris kolonnák alkalmazása is gyakori (pl. BP-1 kémiailag kötött megosztó fázissal). Mintakapacitásuk azonban lényegesen kisebb, mint a töltött kolonnáké. Rosher et al. (1985) az abszcisszinsav metilezett származékát mérték GC-MS-sel, kapilláris GC-kolonnán választva el az egyes mintaösszetevőket. A metilezett mintákat metanolban oldva injektálták (1 μl mennyiségben) a 40 °C-os oszlopba, (50:1 arányú) megosztásos módszerrel. Az oszlop hőmérsékletét az injektálás után 1 perccel kezdték el növelni, 200 °C-ig ballisztikus görbét követve, majd 5 °C/perc intenzitással 250 °C-ig. Az injektor hőmérséklete 250 °C, a hélium vivőgáz nyomása 0,2 MPa volt. Az elválasztott, oszlopból kiáramló komponenseket tömegspektrométer ionforrásába vezették.

Az abszcisszinsav mennyiségi meghatározása

  • Az abszcisszinsav GC-MS analízise

A tömegspektrométer gázkromatográfhoz kapcsolva rendkívül érzékeny és sokoldalú mérési lehetőséget nyújt. Teljes tömegspektrum felvétele helyett – más növényi növekedésszabályzók méréséhez hasonlóan – az ABS esetében is csak egy vagy néhány, adott m/z értékű töredékion intenzitását követik nyomon (SIM- és MIM-módszer). Szelektív ion megfigyeléskor (SIM) a készülék csak azt az intenzitást méri, amit az ABS metilészterének egy bizonyos töredékionja ad. Erre leginkább a 190 m/z értékű részecske alkalmas. A Me-abszcisszinsav – elektronütköztetéssel ionizálva – a következő m/z értékeken ad jellemző fragmentumokat (70 eV ionizációs potenciál hatására): 190, 162, 146, 134, 125, 112, 91. Az ionok által adott jel intenzitása arányos a beinjektált ABS mennyiségével, ezért kalibrációs görbe készíthető, ami lehetővé teszi ismeretlen abszcisszinsav-tartalmú minták mennyiségi vizsgálatát.

  • Az abszcisszinsav kvantitatív szerológiai meghatározása

Rosher et al. (1985) gyenge vízellátással stresszelt almafacsemeték és csemegepaprikatövek leveleiben radioaktív szerológiai módszerrel (RIA) határozták meg az ABS menynyiségét. A növényi extraktumokat először folyadék–folyadék-megoszlással (éterrel), azután PVP-oszlopon, majd szilárd fázisú extrakcióval (ODS-oszlopon) tisztították, végül a mintákban lévő komponenseket HPLC-vel választották szét. A RIA-vizsgálatokat 5 ml-es polietilén szcintillációs csövekben végezték. A csövekbe 400 μl 0,2 M-os Na-acetát/ecetsav-puffert (pH 4,0) pipettáztak. Hozzáadtak 100 μl tríciummal jelölt ABS-t (kb. 670 Bq; 0,635 TBq/mmol), továbbá 100 μl ABS standard oldatot, megfelelő hígításban (0,19–100 pmol tartományban; 2-szeres hígítási lépésekben), vagy 100 μl mintát, továbbá 100 μl 1,5%-os PVP-oldatot, vagy ugyanennyi desztillált vizet. Az elegyet Vortex-szel kevertették, végül hozzámérték a 100 μl ABS-antiszérumot (250-szeres hígításban). Az említett kompetíciós elegyek mellett olyan csövet is beállítottak, amellyel a maximális izotóppal jelölt ABS-kötődést (Bmax-ot) mérhették (nem adtak hozzá sem mintát, sem ABS-standardot). A nem specifikus kötődés mértékét olyan elegyben határozták meg, ami nem tartalmazott antiszérumot, ezt az értéket minden mérési eredményből levonták. Az így elkészített csöveket 4 °C-on 90–120 percig tartották. Az antitestekhez (immunglobulinokhoz) specifikusan kötődött ABS-molekulákat az IgG-fehérjék kicsapásával választották el a nem kötődött frakciótól. Ezt telített ammónium-szulfát 90%-os oldatával (1 ml) végezték, majd 30 perc inkubációs idő után a kicsapódott szilárd fázist centrifugálták (10 percig, 2500 g-vel) és a felülúszót leöntötték. A precipitátumot telített ammónium-szulfát 50%-os oldatával (1 ml) ismét elegyítették, centrifugálták és a kicsapott fehérjefrakciót 150 μl vízbe visszaoldották. Az oldathoz ezek után hozzáadták a szcintillációs koktélt (ezt kereskedelmi forgalomban árusítják), ami segít elkerülni azt, hogy az oldat fázisokra váljon szét. Ez alapvető feltétele a megbízható szcintillációs számlálásnak. A szcintillációs számlálóval végül megállapították az oldat által kibocsátott radioaktív sugárzás mértékét, amely minél kisebb volt, annál kevesebb tríciummal jelölt ABS kötődött, tehát a minta (ill. a standard) annál több ABS-t tartalmazott. Az ABS-standardsor alapján kalibrációs görbét szerkesztettek, ami lehetővé tette ismeretlen ABS-tartalmú növényminták kvantitatív vizsgálatát. A számítást a következő (logit transzformációs) képlettel végezték:

amelyben

B: az egyes minták vagy standardok esetében mért radioaktivitás,

Bmax: kompetíciómentes – mintát, ill. standard oldatot nem tartalmazó – elegy radioaktivitása.

Az adatokat koordináta-rendszerben ábrázolva az x-tengelyre került az ABS mennyisége (pmol), az y-tengely mutatta a logit(B/Bmax) értéket.