Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Mérési módszerek és értékelésük

Mérési módszerek és értékelésük

Az aktív oxigénformák instabil természetűek, spontán és enzim katalizálta reakcióik nagyon gyorsak, felezési idejük a másodperces időintervallumba esik. Mindez megnehezíti közvetlen mérésüket a növényben. Ugyan a leegyszerűsített gazda–parazita kapcsolatok, pl. a növényi sejtkultúra-szuszpenzió és baktérium-szuszpenzió, esetleg a kórokozóból izolált elicitor-molekula és a növényből izolált organellumok áthidalják a módszertani nehézségeket, de vajon mennyire tükrözik a növényben lejátszódó eseményeket?

Az AOF kórélettani szerepéről eddig felgyülemlett ismeretanyag többsége, pl. a védekezési folyamatok, bizonyos gének expressziójának, valamint a sejtfal megszilárdításának indukálása, a hiperszenzitív reakcióban betöltött szerepük stb. főleg a fent említett modell-kapcsolatokból származik. Az AOF meghatározására szolgáló mérési módszereket és indikátorokat, valamint előnyeiket és bizonyos hátrányaikat a 23. táblázat foglalja össze (Schroeder et al., 1996).

23. táblázat - Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után módosítva)

Jelzőanyag

Alkalmazott módszer

Kimutatott anyag

Kimutatási határ

Módszerek előnyei (+), hátrányai (–)

Keményítő/KI

agarlemezek

szövetlenyomat

H2O2

500 µM

+ lokalizácó

– szükséges a mért anyag

kiválasztódása a növényből

– a háttér elszíneződése a levegő okozta

oxidáció miatt

– nehéz alkalmazhatóság az ún.

„száraz” szövetrészeknél,

mint pl. a levelek

CeCl3

elektronmikrosz-

kópos vizsgálat

H2O2

+ sejtszintű és szubcelluláris lokalizáció

– anyag- és eszközigény

(IV)Cl4

növényi kivonattal

végzett kolori-

metriás mérés

H2O2

50 µM

+ mennyiségi meghatározás

+ növényi pigmentek zavarják a

meghatározást; aktív szénnel vagy

erős anioncserélővel színteleníteni

kell a mérést megelőzően

4-nitro-tetrazó-

lium-kék (NBT)

infiltráció

O2

+ lokalizáció

+ O2-ra specifikus

Diamino-benzidin

(DAB)

infiltráció

lumineszcencia

H2O2

+ lokalizáció

Luminol

növényi

kivonatokban

H2O2

l 1 µM

+ mennyiségi meghatározás


KJ / keményítő módszer

A H2O2 termelődésének megállapítására szolgáló legkönnyebb módszerek közé tartozik. A módszer a jodidionok H2O2 általi oxidációjára épül, a keletkezett jód komplexképződés közben reagál a keményítővel és színes, kékeslila elszíneződést okoz. Ez az egyszerű reakció több módszer alapja. A módszerek előnye, hogy anyag- és műszerigénye kicsi, valamint lehetővé teszik a H2O2 lokalizációját. Hátrányaik: a degradálódási folyamatok, a háttér elszíneződése, amely a jódnak a levegő általi oxidációjából fakad, valamint a kiválasztási folyamatok fizikai akadályai, így a kis víztartalmú szöveteknél, mint pl. a levelek, nehezen alkalmazható, másrészt érzékenysége csak az 500 μM-os érték körül mozog.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (agarlemezes módszer)

A növényi szövet H2O2-tartalmának meghatározása Olson és Varner (1993) módszere alapján történik. A fiatal növények gyökereit vagy a levelekből kivágott korongokat (esetleg burgonyagumó-szeleteket) 1%-os agarózlemezre helyezzük, amely 50 mM KI-ot és 2–5% keményítőt tartalmaz. A mintákat az elszíneződés megjelenéséig (függ a H2O2 mennyiségétől) szobahőmérsékleten tároljuk (102. ábra).

102. ábra - A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali növény a kontroll, B és C: burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét esetben [Wu et al., 1995 után]

A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali növény a kontroll, B és C: burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét esetben [Wu et al., 1995 után]


A H2O2 meghatározása növényi szövetben (szövetlenyomat-készítéssel)

  1. A „H2O2-nyomtató papír” elkészítése nitrocellulózmembrán- (0,2 μm) darabkák áztatásával történik.

  2. Az áztató oldatot desztillált vízből 100 g/l oldható keményítő és 0,5 mol/l KI hozzáadásával készítjük. A keményítő oldása forralással történik, a KI-ot csak kihűlés után adjuk az oldathoz.

  3. A nitrocellulóz-darabkákat 30 °C-on megszárítjuk, használat előtt sötétben tároljuk, ezzel is megelőzve az esetleges oxidációt. Az áztató oldat tárolhatósága 5 óra, a lenyomatkészítő papíré pedig 2 óra.

  4. A szövetlenyomatok készítése szobahőmérsékleten történik (18–20 °C) Cassab és Varner leírása alapján (1989).

  5. A H2O2-nyomtató papír darabkáit öt réteg vastagságú kromatográfiás papírra helyezzük.

  6. A szövetmetszeteket steril borotvapengével, kézzel metsszük (vastagságuk 0,5–1,0 mm) és azonnal a lenyomatkészítő papírra helyezzük. A műveletet 15 másodpercen belül végezzük, egy papírra 3–6 szövetmetszetet helyezünk.

  7. Ezt követően a metszeteket 16-rétegű steril gézzel betakarjuk, és finoman 60 másodpercig ujjal nyomjuk (a leghatásosabb terhelés 200–300 g között van).

  8. A szeleteket óvatosan (csipesszel) eltávolítjuk, a lenyomatokat 5–10 perces szárítást követően (103. ábra) sztereomikroszkóppal vizsgáljuk (16-szoros nagyítás). A lenyomatok megjelenése a papírokon 5–10 percet igényel, ez elsősorban a H2O2 mennyiségétől függ. Mivel a lenyomatok idővel erősödnek, összehasonlíthatóságuk érdekében az értékelést azonos időközönként végezzük. A lenyomatok 2 óráig tárolhatók sötétben (bár így is látható kevés háttérelszíneződés).

  9. A hozzávetőleges mennyiségi meghatározáshoz kalibrációs sort készítünk. A H2O2-oldat 2,5 μl-es cseppjeit 0–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8 mmol/l-es koncentrációban helyezzük a papírra. Minden értékeléshez friss kalibrációt készítünk (ügyeljünk az azonos időközökre).

  10. Az eredményeket mikroszkópra szerelhető fényképezőgéppel rögzítjük.

103. ábra - H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével [Schopfer, 1994 után]

H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével [Schopfer, 1994 után]


CeCl3 módszer

A CeCl3 elektronsűrű nehézfém, vizes közegben oldott állapotú, a H2O2 cérium-peroxiddá oxidálja. Amíg más módszerek segítségével az AOF jelenlétének meghatározása csak szöveti és sejtszinten lehetséges, addig ezen módszer lehetővé teszi az egyes sejtorganellumokban történő meghatározást. A módszer hátránya, hogy műszer- és költségigényes.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (transzmissziós elektronmikroszkóppal)

A minták előkészítése hagyományos módon történik: fixálás, beágyazás, metszés és festés (Bestwick et al., 1995) alapján. A H2O2 lokalizálására szolgáló módszer a cérium-peroxid keletkezésén alapul.

  1. Az inokulált szövetből 1–2 mm2-es darabokat vágunk, ezeket 1 órán keresztül a frissen készített 5 mM-os CeCl3-oldatban (pH-ja 7,2) inkubáljuk.

  2. A CeCl3-ot 50 mM-os 3-(-morfolino) propán-szulfonsavban (MOPS) oldjuk.

  3. Ezt követően a szöveteket 50 mM-os nátrium-kakodilát- (CAB) pufferben 1 órán keresztül fixáljuk, a puffer 1,25% (v/v) glutár-aldehidet és 1,25% (v/v) p-formaldehidet is tartalmaz (pH-ja 7,2).

  4. A fixáció után a szöveteket 2 × 10 percen át mossuk CAB-pufferben, és 45 percen keresztül utófixálást végzünk 1% (v/v) ozmium-tetroxidot tartalmazó CAB-pufferben.

  5. A szöveteket újra 2 × 10 percig CAB-pufferben mossuk.

  6. Növekvő töménységű etanol-sorozatban dehidratálást végzünk 30, 50, 70, 80, 90% (v/v). A mintákat minden etanololdatban 15 percig tartjuk, majd 3 × 20 percre 100%-os etanolba helyezzük (a dehidratálást esetleg acetonnal is végezhetjük, ebben az esetben aceton–gyanta keverékbe ágyazzuk a mintákat).

  7. A további eljárás során a mintákat 2 × 20 percre propilén-oxidba helyezzük, majd folyamatosan beágyazzuk Eponaralditba.

  8. A szövet 12 órára tiszta gyantába, majd újabb 4 órára friss gyantába helyezzük.

  9. Ezt követően 48 órára a 60 °C-os polimerizáló blokkokba kerül.

  10. A mikrotómos metszést gyémántkéssel végezzük (70–90 nm).

  11. A metszeteket bevonatlan rézrácsra (Cu-grid, 300 mesh) helyezzük és transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáljuk (75 kV-os gyorsító áram).

Ti(IV)Cl4 módszer

A módszer perhidroxid komplex képződésén alapul. Bár a növény levélszövetének számos pigmentje ugyanazon a hullámhosszon abszorbeál, mint a titániumkomplex, a módszer mégis alkalmazható, de csak aktív szenes derítés, esetleg anioncserélő gyanta alkalmazása mellett. A levelek folyékony nitrogénben való fagyasztása, az 5%-os triklór-ecetsav, az aktív szén alkalmazása és az ammónium-hidroxiddal való semlegesítés megfelelő elszíntelenítést eredményeznek. A módszer hátránya a pigmentek interferenciáján kívül az, hogy bár kvantitatív meghatározásra nyújt lehetőséget, érzékenysége csak 50 μM-os határ körül mozog, ennél ugyanis jóval érzékenyebb módszerek is léteznek.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (spektrofotometriásan)

Az itt részletezett két mérési módszer kolorimetrián alapuló spektrofotometriás mérés. Az A-módszer Patterson et al. (1984), míg a B-módszer Okuda et al. (1991) nevéhez fűződik.

A-módszer

Az első módszer a semlegesített TCA-s kivonáson és a Ti(IV)-PAR komplexképződésen alapul.

  1. A leveleket (2 g) folyékony nitrogénben fagyasztjuk, majd 1 ml 5%-os triklór-ecetsavval és 0,7 g aktív szénnel együtt eldörzsöljük.

  2. Az extraktumot centrifugáljuk (18 000 g, 10 perc, 0 °C-on) és egyben szűrjük (0,45 μm). Mindaddig ismételjük a szűrést, amíg az összes aktív szenet és kicsapott fehérjét el nem távolítottuk.

  3. A szűrlethez a 8,4-es pH eléréséig 7 M-os NH4OH-oldatot adunk.

  4. Újabb szűrést végzünk, és az így kapott szűrletet 1 ml-es egyenlő részekre osztjuk, a minták felébe 1 μg katalázt teszünk.

  5. Az összes mintát 20 °C-on 10 percig inkubáljuk, majd kolorimetriás reagenst adunk hozzá.

  6. A mintákhoz ismert mennyiségben és egyenlő arányban 4-(2-piridilazo)-rezorcinol (PAR) és kálium-titánium-oxalát komplexét adjuk hozzá.

  7. Mindkét oldatot 6 × 10–4 töménységben készítjük, és úgy elegyítjük, hogy pH-ja 8-as legyen.

  8. A szín 45 °C-on egy óra múlva jelenik meg. A spektrofotometriás méréseket 508 nm-en végezzük.

B-módszer

  1. A leveleket (0,2 g) előhűtött (0 °C) dörzsmozsárban 2 ml 0,2 N-os HClO4-ban 0,1 g kvarchomokkal eldörzsöljük.

  2. A mintákat 5 percig 20 000 g-n centrifugáljuk, majd a felülúszót 4 N-os KOH-dal 7,5-ös pH eléréséig lúgosítjuk.

  3. Az így kapott oldatot 1 percig 1000 g-n centrifugáljuk.

  4. A felülúszó 200 μl-ét 1 ml-es anioncserélő oszlopra (0,8 × 2 cm, AG-1) visszük fel.

  5. Az oszlopot 800 μl desztillált vízzel mossuk, és az így nyert oldatot alkalmazzuk a H2O2 meghatározására.

  6. A reakcióelegy 1,5 ml végtérfogatában 1 ml felülúszót, 400 μl 12,5 mM-os 3-N,N-dimetil-amino-benzoesavat (0,375 M-os foszfát-pufferben oldva, pH-ja 6,5), 80 μl 3-metil-2-benzotiazolin-hidrazont és 20 μl peroxidázt (0,25 egység) tartalmaz.

  7. A peroxidáz hozzáadása után az abszorbancia változását 25 °C-on, 590 nm-en (két fényutas) spektrofotométerben követjük nyomon.

  8. A mért értékeket korrigáljuk 15 percig 20 °C-on inkubált 10 egység kataláz hozzáadásával készült minta abszorbanciájával.

4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszer

Amíg az indikátorok egy része a H2O2-ra specifikus, addig az NBT a O2-ra szelektív. A redukción kívül a sárga NBT lilás-barnás formazánná csapódik ki. A növényi szövetekbe történő bejuttatásának több lehetősége van. A szukkulens szövetekbe felszívással juttatható be, de vákuminfiltrálni is lehetséges. A felszívás során a xilém és a floém azonban jelentős mennyiségű festéket emészt, valamint az ott felhalmozódott csapadék elzárhatja a transpiráció útját. Ez a bejuttatási módszer amellett, hogy anyagigényes, a csapadék feltorlódása miatt sem tökéletes. Ezért a vákuminfiltrálással történő bejuttatás jobban ajánlható. A módszer előnye, hogy sejtszintű lokalizációt tesz lehetővé.

A O2 meghatározása növényi szövetekben (specifikus indikátor alkalmazásával)

A O2 szöveti festése tehát az NBT-vel való speciális reakción alapszik (Doke és Ohashi, 1988).

  1. 10 mM-os kálium-foszfát-pufferben (pH 7,8) 0,5% (w/v) NBT-t, 10 M NADPH-t és 10 M EDTA-t oldunk. Az oldat fényérzékeny, készítésekor a lombikot fóliával takarjuk, oldás után szűrjük.

  2. A növényi részt (pl. levélkorongokat) az oldattal vákuminfiltráljuk.

  3. Ezt követően 25 °C-on inkubáljuk, 15 perc múlva a szövet azon részeiben, ahol O2- termelődés észlelhető, megjelenik a formazán lilás-barnás elszíneződése.

  4. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, bár a reakció szabad szemmel is jól látható. Mikroszkópra szerelhető fényképezőgéppel felvételeket készítünk (104. ábra).

104. ábra - Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során keletkező formazán elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun NN dohány levélkorongjain [Doke és Ohashi, 1988 után]

Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során keletkező formazán elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun NN dohány levélkorongjain [Doke és Ohashi, 1988 után]


Diaminobenzidin (DAB) módszer

A H2O2-ra specifikus reakció elsősorban keletkezési helyének meghatározására alkalmas. Bár az irodalomban elsősorban gomba–gazda kapcsolatoknál alkalmazták ezt a módszert (Thordal-Christensen et al., 1997), egyszerű és nem túl műszerigényes volta révén vírus–gazda kapcsolatra is átdolgozható.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (specifikus indikátorral)

  1. A levágott inokulált leveleket 8 órán át 3,3’-diaminobezidin-HCl 1 mg/ml-es 3,8-as pH-jú oldatában inkubáljuk (az alacsony pH a DAB oldódásához szükséges). A DAB-oldatot készíthetjük aszkorbinsav (10mM) hozzáadásával is.

  2. A H2O2 keletkezésének helyén vörösesbarna elszíneződés jelenik meg. A minták vizsgálata különböző időpontban történik.

  3. A reakció megjelenését követően a vizsgált epidermisznyúzatokat fixáljuk, ami történhet 30%-os glicerin és 30%-os tejsav oldatával vagy 96%-os forró etanol-oldatban (10 perc).

  4. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, majd fényképezőgéppel felvételeket készítünk.

Kemilumineszcenciás módszer

A módszer H2O2 növényiszövet-kivonatokban történő meghatározására alkalmas. Amellett, hogy specifikus, igen érzékeny. Összehasonlítva a Ti(IV)Cl4-os módszerrel, érzékenysége legalább 50-szeres (l 1 μM). Ugyanazon kísérleti beállítás során a két módszert összehasonlítva ez utóbbival, szignifikáns eltérések mutathatók ki, míg Ti(IV)Cl4-dal nem. A H2O2 mennyisége luminométerrel mérhető és a kibocsátott fény intenzitásával arányos. A növényi kivonat készíthető HClO4-val is (Chen et al., 1993). A lumineszcenciás módszerek (peroxidáz katalizálta lumineszcencia) jól alkalmazhatók sejtszuszpenzióban is, mind az AOF képződésének, mind a H2O2-elbontó aktivitás meghatározására (Glazener et al., 1991). Az itt részletezett módszer Warm és Laties (1982) munkájából származik.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (luminol segítségével)

  1. A H2O2 meghatározásához vett növényi mintákat (egyenként 5 g-ot) folyékony nitrogénben fagyasztjuk.

  2. 20 ml 5%-os, 4 °C-os triklór-ecetsavban (TCA) előhűtött dörzsmozsárban homogenáljuk.

  3. A növényi kivonatot tartalmazó minták mellett belső standardot és vakmintát is készítünk. A belső standardhoz és a vakmintához 3 μmol H2O2-ot (1–5 μmol H2O2) adunk a homogenálást megelőzően. A vakminta 25 ml 5%-os TCA, amely nem tartalmaz növényi kivonatot.

  4. A mintákat 30 percig 12 000 g-n centrifugáljuk.

  5. A felülúszók 1 ml-ét, a növényi kivontaban lévő színes vegyületek kiszűrése érdekében, anioncserélő oszlopon engedjük át, mintánként kétszer (0,7 × 4 cm, 100 mg Dowex AG 1-X8).

  6. A vak- és standard mintákkal ugyanígy járunk el.

  7. Az így kapott kivonatok 50 μl-ének H2O2-tartalmát 50 μl 0,5 mM-os luminol (3-aminoftálsav-hidrazid) segítségével mérjük. A luminolt 0,2 M-os NH4OH-ban oldjuk (pH 9,5).

  8. A kemilumineszcenciát 100 μl 0,5 mM-os K3Fe(CN)6 (0,2 M-os NH4OH-ban oldva) injektálásával indukáljuk.

  9. Az emittált fotonokat 5 másodpercig pulzusintegrátorral számláljuk.

  10. A H2O2-specifikus kemilumineszcencia megállapítására az elszíntelenített növényi kivonat 1 ml-éhez (Tris-HCl-pufferben, pH-ja 7) 500 egység katalázt adunk, ezt 10 percig 30 °C-on inkubáljuk, majd ismételten mérést végzünk. A két mérés különbsége (ΔCL) a H2O2-specifikus kemilumineszcencia.

  11. A H2O2 egyéb lebomlásának, esetleg más komponensek interferenciájának kiszűrésére szolgál a belső standard és a vakminta, a levonásuk után kapott kemilumineszcencia, a nettó kemilumineszcencia (net CL) arányos a minta H2O2 mennyiségével, amit kalibrációs görbe segítségével határozunk meg.

Egyéb mérési módszerek

Az aktív oxigénformákat fluoreszcenciás és elektronspínrezonanciás módszerekkel is mérhetjük; ezek igen gyakori mérésformák. A fluoreszcenciás módszerek kitűnően alkalmazhatók sejtkultúrákban az AOF keletkezésének detektálására, elsősorban a H2O2 meghatározására. A H2O2 keletkezése szkopoletin fogyásával határozható meg, spektrofluoriméter (460/350 nm) segítségével (Levine et al., 1994). Fluoreszcenciás módszer alkalmazható a membrán-lipidfázisok változásának meghatározására. A fluoreszcein-diacetát apoláros molekula, amely könnyen áthatol a membránok lipidfázisán, ott elveszíti acetát részét, és poláros fluoreszcein keletkezik, amely már nem tud a membránokon áthatolni. Így a plazmamembránok permeabilitásának változása jól nyomon követhető a fluoreszcein-diacetát akkumulációjával, a sejtek észterázaktivitásával, valamint a fluoreszcein kiáramlásával (Keppler et al., 1988).

Fluoreszcens mikroszkópia is alkalmazható a sejthalál detektálására, ahol az élő sejteket fluoreszcens festékkel, neutrálvörössel festjük (Koga et al., 1988). Ez utóbbi két módszer az egyéb közvetett mérési lehetőségek közé tartozik.

Az elektonspínrezonancia-spektroszkópia (ESR) paramágneses tulajdonságú anyagok tanulmányozására alkalmas spektroszkópiás módszer. Ilyenek a párosítatlan elektronú atomok, szabad gyökök, néhány molekula, mint pl. NO, O2, olyan féminok, amelyek d és f elektronhéja csak részlegesen betöltött stb. A módszer többek között alkalmas paramágneses anyagok koncentrációjának meghatározására, 10–9–10–10 mol/l határokig. Ez az intervallum lehetőséget nyújt az AOF mennyiségének pontos megállapítására. A módszer az AOF-nak izolált membránban és mikroszómafrakcióban történő meghatározására alkalmas.

Egyéb (közvetett) mérési lehetőségek

A fertőzött növényi szövetekben az AOF mérésén kívül számos más mérési lehetőség is van, amely mérések eredményei közvetve utalnak az AOF megnövekedett mennyiségű, a természetestől eltérő jelenlétére. Ide tartoznak az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok meghatározásai. Az enzimaktivitások és a nem enzimatikus antioxidánsok változásának mérésére több módszer is lehetőséget nyújt. Mérhetők spektrofotometriásan, gélelektroforézis segítségével és kemilumineszcenciásan.

Az AOF által okozott és befolyásolt kórélettani folyamatok szintén számos alternatívát nyújtanak. A nekrotikus foltok megjelenésével járó gazda–parazita kapcsolatok esetében egyszerű indikátoros festéssel meghatározhatók az elhalt sejtek, akár az egysejt-nekrózisok is. A nekrózisok során bekövetkező sejthalál egyik jellemző folyamata a sejtmembránok szétesése, amely a membránpotenciál változásával, valamint elektrolit- (ion-) kiáramlással jár. Az ilyenkor lejátszódó lipidperoxidáció az egyik legjellemzőbb folyamat. Mérése mind spektrofotometriásan, mind termolumineszcenciásan elvégezhető.

Enzimaktivitások mérése spektrofotometriás módszerrel

A Halliwell-Asada-ciklus antioxidáns enzimeinek mérése spektrofotometriásan történik.

  • Mintavétel

A mintavétel során ügyelni kell arra, hogy a fertőzött növény folyamataira jellemző mintát vegyünk. Az egyes folyamatok erőssége levélszintenként különbözhet, mint ahogy a vírussal való fertőzhetőség is változó levélszintenként. A különböző vírus–gazda kapcsolatok tüneti megnyilvánulása befolyásolja a mintavétel időpontját és helyét. Az enzimaktivitások a lokális nekrotikus és klorotikus tünetek esetében a fertőzési helyekhez közel eső szövetrészekben változnak jelentősebben, így a foltokat közvetlenül körülvevő, még zöld szövetrészekből vegyük a mintát. Az egészséges növény példányai között is lehetnek jelentős eltérések az élettani folyamatokban, ezért a nagyszámú mintavétel ajánlott.

  • Nyers enzimkivonatok készítése

  1. A levélszövetet, mintánként 0,5 g-ot, 3 ml hideg homogenáló pufferben, előhűtött dörzsmozsárban eldörzsöljük. A homogenáló puffer 0,05 M-os TRIS-HCl-puffer (7,8 pH), amely 7,5% (w/v) polivinil-pirrolidont (vízoldható) és 1 mM EDTA-Na2-t tartalmaz.

  2. A homogenizátumot centrifugáljuk (5000 g, 20 perc, 4 °C), és a felülúszót alkalmazzuk az aktivitások méréséhez.

    • Aktivitások meghatározása

A spektrofotometriás méréseket ellenőrzött hőmérsékletű küvettaházban, 25 °C-on végezzük (Shimadzu-CPS240A spektrofotométer).

  • Aszkorbát-peroxidáz (AP) aktivitásának mérése

Az AP aktivitásának mérése Nakano és Asada (1981) módszere alapján történik.

  1. Az aktivitásmérő elegy 2,25 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 5,625 mM-os aszkorbinsav-oldatot, 50 μl nyers növényi enzimkivonatot és 100 μl 11,25 mM-os hidrogén-peroxid-oldatot tartalmaz.

  2. Az abszorpcióváltozást kvarc küvettában 290 nm-en 3 percig mérjük.

  3. Ezt követően újabb aktivitásmérő elegyet készítünk, amely nem tartalmaz hidrogén-peroxidot, és újabb 3 percig követjük az aszkorbinsav fogyását. Az aszkorbinsav moláris extinkciós koefficiense 290 nm-en 2,8 mM–1 cm–1. Az aktivitás kiszámolásánál a két mérés különbségét alkalmazzuk:

  • Dehidroaszkorbinsav-reduktáz (DHAR) aktivitásának mérése

A DHAR aktivitásának mérése Asada (1984) módszere alapján történik.

  1. Az aktivitásmérő elegy 2,3 ml végtérfogatában 2 ml 0,05 M-os nátrium-foszfát-puffert (a puffer tartalmaz 0,1mM EDTA-Na2-t, pH 6,5), 100 μl 0,5 mM-os dehidroaszkorbinsav-oldatot (a dehidroaszkorbinsavat és a glutationt pufferben oldjuk), 100 μl 1 mM-os redukált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi enzimkivonatot tartalmaz.

  2. Az abszorpcióváltozást 3 percig 265 nm-en kvarc küvettában mérjük, majd újabb aktivitásmérő elegyet készítünk növényi enzimkivonat nélkül, és újabb mérést végzünk. Az aszkorbinsav moláris extinkciós koefficiense 14 mM–1cm–1. Az aktivitás számításánál a két mérés különbségét alkalmazzuk.

    • Glutation-reduktáz (GR) aktivitásának mérése

A GR aktivitásának mérését Halliwell és Foyer (1978) módszere alapján végezzük, figyelembe véve Klapheck et al. (1990) módosításait.

  1. Az aktivitásmérő elegy 2,5 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 2,4 mM-os NADPH-t, 300 μl 5 mM-os oxidált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi enzimkivonatot tartalmaz.

  2. Az abszorpcióváltozást 3 percig 340 nm-en mérjük, majd új reakcióelegyet készítünk, melyhez nem adunk glutationt, és ismételjük a mérést. A glutation moláris extinkciós koefficiense 6,2 mM–1cm–1. Az aktivitást itt is a két mérés különbségéből számoljuk.

Elhalt sejtek festése Evans-kék indikátorral

A fertőzött növény leveleiből levélkorongokat vágunk, amelyeket Evans-kék biológiai indikátor 1%-os desztillált vizes oldatával infiltrálunk, és 15 percig inkubáljuk. Az infiltrálást a gazda-parazita kapcsolattól függően különböző időközönként végezzük. Az Evans-kék csak az elhalt sejteket festi meg. A szöveteket fénymikroszkóppal vizsgáljuk, fényképezőgéppel felvételeket készítünk.

Az ionkiáramlás mérése levélkorongokból

A sejthalál jól jellemezhető az ionkiáramlás mérésével. A módszer az oldatok vezetőképességének változásán alapul. A fertőzött növény leveleiből az egyes mérésekhez 5–5 levélkorongot vágunk (∅ = 9 mm). A levélkorongokat fonákjukkal felfelé, 5 ml desztillált vízben úsztatva, szobahőmérsékleten 3 órán át inkubáljuk. Ezt követően konduktivitásmérővel mérjük az úsztatóoldat vezetőképességét (Mittler et al., 1996).

A lipidperoxidáció mérése

A lipidperoxidáció mérését spektofotometriásan végezzük Heath és Packer (1968) módszere alapján, figyelembe véve Dhindsa et al. (1981) módosításait. A módszer elve a malondialdehid (MDA) mérésén alapul, amely a lipidperoxidáció során keletkező korai termék.

  1. Mintánként 0,5 g levelet folyékony nitrogénben fagyasztunk, majd dörzscsészében elporítunk.

  2. Az így előkészített mintákat 2 ml 0,2 M-os citrát-foszfát-pufferben (6,5 pH) – ami tartalmaz 0,5% Triton-X 100 detergenst is – szuszpendáljuk, majd a homogenátumot centrifugáljuk (20 000 g, 15 perc).

  3. A felülúszó 1 ml-ét 2 ml, hűtött, 0,5%-os (v/v) 2-tiobarbitursavat (TBA) tartalmazó 20%-os (w/v) triklór-ecetsavval elegyítjük, és 95 °C-os vízfürdőn 45 percig inkubáljuk, végül 15 percig olvadó jégben hűtjük.

  4. Centrifugáljuk, s az így kapott felülúszó abszorbanciáját 532 nm-en mérjük.

  5. A nem specifikus abszorbanciát 600 nm-en mérjük, és a kapott adatot kivonjuk az előző mérésből. Az így kapott adatot használjuk az MDA extinkciójának számításánál. Az MDA moláris extinkciós koefficiense 155 mM–1cm–1.