Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei

Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei

A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni extrém rezisztencia

  • A szülőpartnerek kiválasztása és vizsgálata

A nemesítési cél meghatározását követően ki kell választani azokat a keresztezési partnereket, amelyekkel a kitűzött cél várhatóan a leghatékonyabban és a leggyorsabban érhető el (Horváth, 1968; Ross, 1986; Foxe, 1992). Rendszerint meglévő fajtába vagy értékes nemesítési vonalba próbálják bevinni a kiválasztott rezisztenciagént. A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szemben extrém rezisztenciát nyújtó, dominánsan öröklődő Ry gént Solanum stoloniferum (Rysto) és S. tuberosum ssp. andigenum (Ryadg) növényekben azonosították. Az Rysto extrém rezisztenciát ad a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben is, míg az Ryadg nem. A S. stoloniferum növénnyel történő keresztezés eredményeként citoplazmatikus hímsterilitás (CMS) lép fel az utódokban, ami a S. tuberosum sejtmagi és a S. stoloniferum citoplazmai genetikai állománya összeférhetetlenségének a következménye. Ennek eredményeként az extrém rezisztenciát hordozó utódok csak anyaként használhatók fel, ami a visszakeresztezési programok hatékonyságát csökkenti. A vad, illetve primitív fajokkal történő keresztezés esetén számítani kell arra, hogy a felhasznált genotípusok kedvezőtlen tulajdonságai (egyes morfológiai bélyegek, a kívánatosnál több gumókötés, sérülésérzékenység, rossz íz, magas alkaloidtartalom stb.) megjelenhetnek az utódokban, ezért ha mód van rá, kultúr genotípusokat kell használni. Ma már számos, kiváló kultúrtulajdonsággal rendelkező burgonyafajta tartalmazza az Ry gént. A nemesítési programot a CMS figyelembevételével célszerű megtervezni. Meg kell azonban jegyezni, hogy a fajtaszabadalom bevezetése óta a szabadalmaztatott fajták genetikai állományának felhasználásához a nemesítő, illetve fajtatulajdonos hozzájárulása szükséges. Amennyiben valamilyen fontos ok miatt a nemesítési programban vad fajokat használunk fel, azok különböző nemzetközi génbankokban hozzáférhetők (Horváth, 1988). Itt azonban figyelembe kell venni, hogy a vad Solanum fajok különböző származékainak rezisztenciája eltérő lehet, ezért pontosan azonosítható vonalakat kell használni, vagy a nemesítő csoport virológusának kell megvizsgálnia a rezisztenciaszintet (Horváth és Hoekstra, 1989; Bősze et al., 1996). A nemesítési alapanyag külföldről, különösen más kontinensről történő beszerzése komoly veszélyeket rejt magában (Howell, 1981; Horváth et al., 1993a). Éppen a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) dohány érnekrózis törzsének (PVYN) nemesítési alapanyaggal Dél-Amerikából Európába kerülése igazolja ezt a veszélyt. Ezért alapvető követelmény, hogy a beérkezett genotípusok kórokozó-mentességét karantén körülmények között – e könyv más fejezeteiben ismertetett – in vitro és in vivo módszerekkel igazoljuk. Mielőtt egy kiterjedt nemesítési programban szülőpartnerként felhasználnánk valamely fajt vagy fajtát, célszerű vele megfelelő számú tesztkeresztezést végezni, a kombinálni kívánt tulajdonságok öröklődése, valamint a fertilitási viszonyok megállapítása céljából. Az apai vonalak pollenjének fertilitása kárminecetsavas festéssel egyszerűen megállapítható.

  • Kárminecetsavas festés

  1. 5 g kármint horzsakő jelenlétében, 100 ml 45%-os ecetsavban 30 percig forralunk.

  2. A festékoldatot kihűlés után leszűrjük.

  3. A vizsgálandó pollenből vett mintát (min. 200 pollen) tárgylemezre helyezzük, és 2 perces kárminecetsavas festést követően megvizsgáljuk a megfestődött pollenszemek arányát.

  4. Ha a mintában 10%-nál kevesebb pollen festődik meg, akkor a vizsgált fajt (fajtát) apai szülőpartnerként alkalmatlannak kell tekinteni.

Megjegyzés: A módszer gyors és egyszerű, megbízhatósága azonban nem minden esetben kielégítő.

  • Fluoreszcein-diacetátos (FDA) festés

  1. 0,5 ml szacharózoldathoz 1 ml acetonban feloldott 2 mg FDA-t kell adni.

  2. A pollenmintát 30 percig inkubálni kell az oldatban, majd vízzel kimosni.

  3. Az enzim hatására keletkezett fluoreszcinmennyiséget UV-lámpa alatt lehet vizsgálni.

Megjegyzés: Ez a módszer a legbiztonságosabb.

A partner-előállító (genetikai) vagy a közvetlen fajta-előállító program céljainak megfelelő szülőpartnerek kiválasztása során figyelembe kell venni, hogy a keresztezés során előállított magoncokat és azok utódait mintegy 50 tulajdonságra kell vizsgálni. Ehhez megfelelő számú magonc előállítása és megfelelő számú keresztezési kombináció alkalmazása szükséges. A jelenleg elfogadott álláspont szerint a keresztezési kombinációk számának növelése hatékonyabb megoldás, mint egy keresztezési kombináción belül a magoncok számának növelése. Az egy nemesítési program (nemesítő intézet) számára évenként javasolt keresztezési kombinációk száma 150–300, az egy kombinációban előállított magoncok száma pedig 400–500.

Keresztezési technikák

A nemesítési tervnek megfelelő számú magonc előállításához mindenekelőtt a szülőpárok felneveléséről kell gondoskodni. A szülőpartnerek mind üvegházban, mind szabadföldön felnevelhetők. A virágzás szempontjából a környezeti tényezők közül a fénynek és a hőmérsékletnek van jelentős szerepe. A burgonya (S. tuberosum ssp. tuberosum) a virágfejlődés szempontjából hosszúnappalos növény. A fajták között a megvilágítás időtartama iránti érzékenység szempontjából különbségek vannak, azonban általánosan elfogadott, hogy az optimális virágfejlődéshez legalább 16 órás megvilágítás szükséges. A túl magas és túl alacsony hőmérséklet szintén gátolja a virágzást. Az optimális hőmérséklet 16–22 °C között van. A virágzás jelentős csökkenéséhez vezet, ha az elültetett gumó fiziológiailag öreg (a nyugalmi időszak letelte és az ültetés között túl hosszú idő telik el). Vannak olyan fajok és fajták, amelyek megfelelő környezeti feltételek biztosítása mellett is csak gyenge virágzási hajlamot mutatnak. Ilyen esetben alkalmazhatók a különböző, virágzást indukáló módszerek.

A vegyszeres kezelések kivételével – amelyek hatékonyságáról eltérőek a vélemé-nyek – a módszerek többsége a képződő fiatal gumók eltávolításán vagy a gumóképződés megakadályozásán alapul. A „téglára ültetés” módszere esetén a téglára helyezett gumóból fejlődő növény gyökereit a mélyebb talajrétegbe vezetik. A növény gumó feletti részéről a talajréteget lemosva a képződő fiatal gumók folyamatosan eltávolíthatók. Az asszimiláták gumóképződéshez történő felhasználását azzal is akadályozhatjuk, ha a burgonya hajtását paradicsom alanyra oltjuk. A keresztezések végrehajtására alkalmazott egyszerű módszer az, amikor a szántóföldön begyűjtött, még ki nem nyílt virágzatot a kasztrálást és beporzást követően antibiotikumot tartalmazó vízzel töltött edényekbe helyezik és üvegházi körülmények között nyerik a bogyótermést.

A szülőpartnerként kiválasztott anyai és apai vonalak virágzásának szinkronizálása nehéz feladat. Célszerű az apai vonalak pollenjét előre begyűjteni és a keresztezésig tárolni.

  • A pollen begyűjtése és tárolása

  1. Az érett, de még fel nem nyílt portokokat tartalmazó virágokat szitára helyezzük és 24–48 óráig szárítjuk szobahőmérsékleten.

  2. A pollenszemek a szita rázogatásával a portokokból kinyerhetők.

  3. A pollenszemek a portokokból vibrátorral frissen is kinyerhetők.

  4. A pollen hűtőszekrényben, 4 °C-on 10 napig tárolható. Hosszabb tárolás estén a pollenszemeket 24–48 óráig 30 °C-on szárítjuk, majd fiolákban légmentesen lezárva –20 °C-on tároljuk. Az így tárolt pollenszemek csírázóképességüket hosszú ideig megőrzik (a vizsgálatok szerint 19 hónap után a pollenszemek 87%-a még csírázóképes).

A nemesítők véleménye megoszlik abban a kérdésben, hogy szükséges-e a kiválasztott anyai szülőpartner éretlen portokjainak eltávolítása (kasztrálás) a keresztezés előtt. Egyesek véleménye szerint az önmegporzás, valamint a rovar- és szélmegporzás valószínűsége olyan kicsi, hogy a kasztrálás elhagyható, míg mások a biztos keresztezési kombináció létrejötte érdekében javasolják elvégezni. A kasztrálás akkor végezhető el káros következmények nélkül, amikor a még ki nem nyílt bimbóból a bibe kibújik.

A keresztezéseket a biztosabb megtermékenyülés érdekében célszerű a délelőtti órákban elvégezni, mert a környezeti feltételek ebben az időszakban a legkedvezőbbek.

  • Keresztezés

  1. A pollen felvitelének egyszerű módja egy olyan cső alkalmazása, amelybe a bibe belefér (pl. szívószál). A csövet a végétől néhány mm-re lezárjuk.

  2. A csövet a pollenbe mártva a pollenszemek berakódnak és a bibére húzva azon megtapadnak.

  3. A keresztezéskor a nem megtermékenyített (éretlen vagy elöregedett) virágokat lecsípjük, és a virágzatot a keresztezési kombináció azonosítására alkalmas jelöléssel látjuk el.

  4. A bogyók érés után gyorsan leválhatnak a kocsányról, ezért időben kell begyűjteni őket, vagy hálóból készült, megfelelő szellőzést biztosító zacskót kell kötni köréjük.

  5. A magokat keresztezési kombinációként a bogyóból kiszedjük, és mosással a bogyóhús-maradványokat eltávolítjuk (a bogyóhús csírázásgátló anyagokat tartalmazhat). A magok a mosás és szárítás után gyakorlatilag csírázóképesek.

  6. A magokat jó nedvességtartó képességű szaporítóközegbe vetjük, 1–2 cm mélyen. A talajt folyamatosan nedves állapotban kell tartani, esetleg a csíranövények megjelenéséig a kiszáradás ellen le lehet takarni. Ha az elsődleges nemesítési célok között a burgonya Y-vírus elleni rezisztencia szerepel ebben a fázisban, a magoncok 4–6 leveles fejlettségénél a tömeges inokulációt szórópisztollyal elvégezhetjük.

  7. A magoncokat ezt követően olyan térállásba ültetjük ki, hogy a gumótermés tövenként elkülöníthető legyen. Minden magonc alól 1 gumót gyűjtünk be anyatő céljára.

  8. Az anyatövek, valamint a további nemzedékek (A, B és C klónok) között erős szelekciót végzünk a kívánatos tulajdonságokra (32. táblázat).

32. táblázat - Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva)

Év1

Klónok száma

Gumószám klónonként

Feladatok2

1

400–500 keresztezési kombináció előállítása, legalább az egyik szülőpartner Ro-1- és PVY-rezisztens

2

140 000

Tömeges magvetés és korlátozott negatív szelekció

3

100 000

1

Erős szelekció a növények között vírusfertőzésre, a gumók között termésre, alakra, rügymélységre, hússzínre. Téli vizsgálat Ro-1- és vírusrezisztenciára. A késői érésű genotípusok kiszűrése érdekében kémiai szártalanítás csak augusztus elején végezhető

4

7000

7

A klónok számozása. A növekedési típus, az érésidő és a betegségek felvételezése. Téli vizsgálat ízre, főzési típusra, keményítőtartalomra, elszíneződésre és feldolgozási alkalmasságra. Ismételt vizsgálat fonálféreg-rezisztenciára

5

1400

50

Ugyanaz, mint a negyedik évben

6

7

7

500

(100)

10

250

250

1250

Kisparcellás kísérletek. Rezisztenciavizsgálat

varasodásra, rákra, vírusokra és mindkét nematóda faj patotípusaira. A hetedik év végén döntés a megfelelő hivatalos intézményeknél történő bejelentésekről

8

4

5000

Hivatalos vizsgálatok

9

4

0,75 ha

Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-termelés indítása

10

1

5 ha

Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-termesztés


1 A 6. évtől kezdve a kétséges klónok ismételt vizsgálata.

2 Ro-1, Globodera rostochiensis rassza; PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus).

  • Extrém rezisztencia ellenőrzése burgonyafajtákon (Wiersena, 1972)

Az extrém rezisztencia megléte mesterséges körülmények között is lehetővé teszi a fajták vizsgálatát már palántakorban.

  1. Magról nevelt fiatal burgonyapalántákat burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) vagy burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) – esetleg mindkettővel – inokulálunk, felső festéktartályos magasnyomású festékszóró pisztoly segítségével. A távolság 2–5 cm, a nyomás 1,5–2 kg/cm3.

  2. A fertőzött növényeket 20–22 °C-os fóliaházban tartjuk legalább három hétig. A tünetes növényeket eltávolítjuk, a tünetmenteseket kiválogatjuk, átültetjük. A módszer a hiperszenzitivitás ellenőrzésére kevésbé alkalmas. A túlélő, tünetmentes növényeket szerológiailag ellenőrizzük.

  3. Ha a kiválasztott növényanyag rezisztenciájáról két- vagy több év után is meg akarunk győződni, a burgonyanövényekről hajtást szedünk, és azt burgonya X-vírussal vagy burgonya Y-vírussal (vagy mindkettővel) fertőzött paradicsomnövényekre oltjuk kertészeti oltással. Az ellenőrzést ELISA-vizsgálatokkal egészítjük ki.

Megjegyzés: A vírusfertőzésekhez célszerű a nekrózist okozó törzseket használni, ami a fiatal, fogékony növényeket egy hét múlva elpusztítja, illetve azokon három héten belül tüneteket okoz. Az inokulumot használat előtt nejlonszűrőn átszűrjük, vagy centrifugáljuk. Az inokulumhoz karborundumport keverünk, de az abrazívum ülepedését a szórópisztoly tartályának enyhe kevergetésével meg kell akadályozni.

Multiplex rezisztenciával rendelkező genotípusok kiválasztása és tesztelése

A multiplex tulajdonságot tesztkeresztezésekkel lehet megállapítani. Ennek során a vizsgálandó genotípust ismerten fogékony (nulliplex) partnerrel keresztezik. Az utódokat mesterségesen fertőzik, és a fertőződött egyedek számából következtetni lehet arra, hogy a rezisztenciagént a genotípus hány lokuszon hordozza.

Számos burgonya-kórokozó, különösen a Phytophthora infestans esetében a rezisztenciát áttörő rasszok megjelenésének nagyobb a jelentősége, mint a vírusoknál. Ilyen törzsek megjelenésének lehetősége, mint számos példa mutatja, a vírusoknál sem zárható ki (Jones, 1985; Van den Heuvel et al., 1994; Feigelstock et al., 1995). Ezért inkább a nemesítési program hatékonyságának növelése szempontjából van jelentősége olyan szülőpartnerek előállításának és felhasználásának, amelyek a rezisztenciagéneket több lokuszon hordozzák. A tetraploid burgonya esetében az érzékeny genotípusokat (rrrr) nulliplexnek, a rezisztenciagént egy lokuszon hordozót (Rrrr) simplexnek, a két lokuszon hordozót (RRrr) duplexnek, a három lokuszon hordozót (RRRr) triplexnek, míg a négy lokuszon hordozót (RRRR) quadriplexnek nevezik. Szülőpartnerrel történő keresztezés esetén az utódok között az ellenálló:fogékony genotípusok aránya simplex esetén 1:1, duplex esetén 5:1. Triplex és quadriplex szülőpartner esetén a mendeli szabályok szerint valamennyi utód rezisztens, de ennél kisebb mértékű eltérés is lehetséges. A multiplex szülőpartnerek felhasználása lehetővé teszi, hogy az előállított genotípusok szelekcióját más, lényeges tulajdonságra végezzük el, így a nemesítési program gyorsítható, hatékonysága növelhető.