Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

19. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei

19. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei

A vírusbetegségek elleni védekezés leghatékonyabb módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása és a rezisztenciára történő nemesítés. A korszerű biotechnológiai módszerek alkalmazása mindkét területen igen sikeres és kifizetődő. Ide szűkebb értelemben azokat az eljárásokat sorolják, amelyekben a növényi sejt genetikai programját az ember megváltoztatja az így kialakított tulajdonságok technológiai felhasználása érdekében. Tágabb értelemben azonban ide tartoznak a különböző szövettenyésztési módszerek is.

A laboratóriumokból kikerülő növényfajtajelölteknek természetesen a szabadföldi kísérletekben is sikeresen kell szerepelniük, hogy azokból engedélyezett növényfajta lehessen. 1987 és 1994 között az Amerikai Egyesült Államokban 1700 helyen végeztek szabadföldi kísérleteket genetikailag módosított, transzgénikus növényekkel. Ezek 31%-a herbicidrezisztens (toleráns), 21%-a rovarrezisztens, 14%-a vírusrezisztens, 3%-a gombarezisztens volt (Schiemann és Casper, 1995). Európában az ilyen szabadföldi kísérletek száma lényegesen kisebb. 1992–1994 között Franciaországban 95, Belgiumban 59, Angliában 58, Hollandiában 51, Olaszországban 23, Németországban 22, Spanyolországban 13, Dániában 11 és Portugáliában 4 szabadföldi kísérletet végeztek transzgénikus növényekkel (Landsmann és Shah, 1995).

Napjainkra már több génsebészeti úton előállított, engedélyezett növényfajtát hoztak forgalomba. Az európai piacon hímsteril (kukorica, olajrepce), herbicid- és rovarrezisztens (dohány, szója, kukorica), valamint vírusrezisztens (burgonya, cukorrépa, dohány, paradicsom) fajták vannak. Hazánkban magyar nemesítésű transzgénikus fajta, ill. fajtajelölt nincs (Heszky et al., 1999).

Általában elmondható, hogy a biotechnológiai módszerekkel olcsóbban és rövidebb idő alatt lehet előállítani egy adott betegséggel szemben toleráns vagy rezisztens fajtát, mint a hagyományos, „klasszikus”, növénynemesítési eljárásokkal (Tepfer és Balázs, 1997; Foster és Taylor, 1998). Fontos azonban megállapítani, hogy a rezisztenciára nemesítés a modern és látványos eredményeket jelentő módszerek bevonásával is csupán versenyfutás marad a növénynemesítő és a kórokozók újonnan megjelenő törzsei, biotípusai vagy rasszai között.

Szomatikus hibridizáció

Termesztett növényeink vad rokonai és ezek különböző származékai számos, jelentős gazdasági károkat okozó vírussal szemben rezisztenciát mutatnak. Ezek a növényfajok és származékaik értékes alapanyagot jelentenek a növénynemesítők számára. Ilyen értékes nemesítési alapanyag pl. a Solanum stoloniferum dél-amerikai vad faj több származéka (PI. 255548, 275245, 275247, 545800 stb.), amelyek extrém rezisztenciát (immunitást) mutatnak a rezisztenciaáttörő képességgel (resistance breaking) rendelkező burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) NTN törzsével szemben (Horváth és Wolf, 1995; Bősze et al., 1996). A hagyományos nemesítési eljárás során a kultúrnövényeket ivaros úton keresztezik a vad fajokkal (származékokkal), hogy a betegség-ellenállóságot a kultúrfajba (fajtába) bevigyék. Az ivaros keresztezés azonban számos faj között nem lehetséges. A protoplasztfúzió új utat nyitott a rezisztenciára nemesítésben, mert lehetővé tette, hogy a szexuális szaporodás megkerülésével olyan fajok egyedeit is keresztezzük, amelyek ivaros módon nem hibridizálódnak és nem hibridizálhatók egymással (Puite et al., 1988; Filippone et al., 1992; Marchant et al., 1993). A módszer azokban az esetekben alkalmazható, melyekben protoplasztokból növényegyedeket tudnak regenerálni. A protoplaszt a növényi sejtfal kíméletes eltávolítása után megmaradó „csupasz” – sejtfal nélküli – sejt. A protoplasztfúzió a (szomatikus eredetű) protoplasztsejtek egyesítését jelenti. Ennek során – ellentétben a szexuális rekombinálódással – a szülői sejtek citoplazmája is egyesül. Mivel a kórokozókkal szembeni rezisztenciát néhány esetben a plasztidok genomja kódolja, a fúziós technikák utat nyitottak olyan egyedek létrehozására, amelyek a citoplazmás genetikai determinánsok új kombinálódásai (cibridek) (Wenzel, 1985). A szomatikus hibridizáció előnye, hogy a többgénes öröklődésű reziszten-ciák is átvihetők a vad fajból a termesztett fajtába. A módszer hátránya azonban szintén abból adódik, hogy egyszerre nagy mennyiségű örökítő anyag kerül át, így azokkal nem kívánt tulajdonságok jelenhetnek meg a nemesített fajtában. A szomatikus hibridek előállítása három lépésben történik: 1. a protoplasztok izolálása, 2. a sejtek egyesítése (fúzió), 3. regeneráció és szelekció.

A protoplasztok izolálása

A növények szomatikus sejtjeiről eltávolítják a sejtfalat. Ez úgy történik, hogy egy növényi szervdarabot egy sejtfalbontó enzimeket (pektináz, celluláz, hemicelluláz – Trichoderma, ill. Rhizopus gombákból) tartalmazó folyékony ozmotikum (általában mannitol- vagy szorbitololdat) felszínére helyeznek, és steril körülmények között inkubálják. A sejtfaluktól megfosztott sejteket, a protoplasztokat elválasztják a törmeléktől, és tápanyagokat tartalmazó tápoldatba helyezik.

A sejtek egyesítése (fúzió)

Jelenleg erre kétféle módszert alkalmaznak: a protoplaszt-szuszpenziókat összekeverik, és ehhez polietilén-glikolt (PEG) adnak, vagy pedig elektromos impulzussal kezelik a sejteket. Ezekre a lépésekre azért van szükség, hogy a negatív töltéssel rendelkező plazmalemma töltésviszonyait megváltoztassák, és így létrejöhessen a protoplasztok összetapadása, illetve egyesülése.

A PEG-gel történő kezelés úgy történik, hogy Petri-csésze aljára csöppentett protoplaszt-szuszpenzióhoz lassan, 2–3 lépésben adják hozzá a PEG-oldatot. A végső PEG-koncentráció 15–20%, de ez növényfajoktól függ. A PEG-es inkubálás időtartama általában 20–30 perc. Ezután a Petri-csésze felületére ülepedett protoplasztokról óvatosan leszívják a PEG-oldatot, és a tenyészetet többször átmossák a táptalajjal. Végül ebben a táptalajban veszik fel a sejteket.

Az elektrofúzióhoz a kis vezetőképességű mannitol- vagy glükóz-ozmotikumban szuszpendált protoplasztokat elektromos küvettába helyezik. Ebben a technikában váltóáramnak és egyenáramnak egyaránt szerepe van. Váltóáram hatására a sejtek – összetapadva – láncot alkotnak az elektródok közötti elektromos erővonalak mentén, egyenáramú impulzus hatására pedig szakadások jönnek létre az érintkező membránokon. A protoplasztok fúziója a membránok újrarendeződésekor jön létre.

Regeneráció és szelekció

A sejtfúziót követően a hibrid sejteket kiemelik a vad típusú protoplasztok közül. Ez mikroszkópos technikák segítségével, illetve antibiotikumok alkalmazásával történhet. A hibrid sejtvonalakból azután hormonkezeléssel növényeket regenerálnak. In vitro szövetkultúrákban a növényi sejtekből – a totipotenciának köszönhetően – teljes növények regenerálódnak. A regenerált növények között nagyok lehetnek a különbségek (szomaklonális variabilitás). Az öntermékenyülő homozigóta kultúrfajoknál a transzgénikus növények szaporítása önbeporzással vagy az eredeti fajtával történő visszakeresztezéssel lehetséges. Az ilyen keresztezések eredményeképpen a szomaklonális variabilitás előfordulási esélye csökken. A vegetatív úton szaporított növényfajoknál – amelyek általában idegentermékenyülők és heterozigóták – a szomaklonális variabilitás előfordulását a minimálisra csökkenthetjük, ha az elsődleges transzgén növények közül szelektáljuk a fajtaazonos transzgén növényeket. A burgonya a szövettenyésztés során magas szomaklonális variabilitásra képes. Ezért e faj esetében azokat a transzformánsokat kell szelektálni, amelyekben a szomaklonális variabilitás nem fordul elő (Huisman et al., 1992).

A protoplasztfúzióval előállított szomatikus hibridek sokszor a további ivaros szaporításra alkalmatlannak bizonyulnak, illetve nemkívánatos tulajdonságok is átkerülhetnek a vad fajokból. A szomatikus sejtgenetika számos biztató eredménye ellenére is a rezisztenciára nemesítés legígéretesebb útja jelenleg mégis a transzgénikus növények előállítása.

Protoplasztok izolálása és növények regenerálása dohányból [Nagy (1992) által módosítva]

  1. Dohány (Nicotiana tabacum) hajtáskultúráit hormonmentes MS táptalajon, 26 °C-on, 2000 lux fényintenzitás mellett, 16 órai megvilágítási idő után 8 óráig sötétben tartjuk.

  2. Steril Petri-csészébe 8 ml sejtfalbontó enzimoldatot (lásd Táptalajok és oldatok) teszünk.

  3. A 4–6 hetes növényekről kifejlett leveleket szedünk.

  4. A leveleket fonákukkal fölfelé steril Petri-csészébe helyezzük.

  5. A levelekre kevés Cellitet szórunk, és ecsettel óvatosan kenegetve megsértjük az epidermiszréteget.

  6. A levelet sértett felületével lefelé az enzimoldat felszínére helyezzük.

  7. A Petri-csészét lezárjuk, és egy éjszakán át 26 °C-on, sötétben inkubáljuk.

  8. A protoplasztokat enyhe, keverő mozdulatokkal szuszpendáljuk, majd 80 μm-es nejlon szűrőn átszűrjük. A szűrőre a sejtszuszpenziót széles szájú pipettával átvisszük.

  9. A szuszpenziót 10 ml-es centrifugacsőbe helyezzük.

  10. A 10 percig történő centrifugálás (60 g) után az intakt protoplasztok a folyadékoszlop felszínén sötétzöld gyűrűt képeznek.

  11. A protoplasztokat Pasteur-pipettával 8 ml-es W5 ozmotikumot tartalmazó centrifugacsőbe visszük át úgy, hogy a táptalajból minél kevesebbet szívjunk fel, majd két percig centrifugáljuk.

  12. A leülepedett protoplasztokról leszívjuk az ozmotikumot és a sejteket 1 ml K3-as táptalajban reszuszpendáljuk.

  13. Egy csepp szuszpenziót Fuchs-Rosenthal- vagy Bürker-kamrába teszünk, és mikroszkóp alatt megszámoljuk a protoplasztokat. Ha a szuszpenzióban túl sok a sejttörmelék, a W5-tel történő mosási lépést meg kell ismételni. Optimális esetben a protoplasztkinyerés 2–3 millió sejt/g friss növényanyag. A protoplasztfúzió vagy a transzformálás PEG-es kezelés, illetve elektromos impulzus hatására következik be.

  14. A protoplasztokat a táptalajjal 105 sejt/ml koncentrációra higítjuk. Ebből a keverékből 4 cm-es átmérőjű Petri-csészékbe 2,5–2,5 ml-t mérünk, majd a Petri-csészéket lezárjuk és 26 °C-ra, sötétbe helyezzük.

  15. A protoplaszttenyésztés, illetve a növényregenerálás a 33. táblázatban leírtak szerint történik.

33. táblázat - Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei

Idő

(nap)

Táptalaj

Ozmotikum

Növekedésszabályzó

Kezelés

Fejlődési állapot

0–5

K3

0,4 M

2 mg/1 NAA,

1 mg/1 BAP

tenyésztés sötétben

protoplasztok,

sejtfal-regenerálódás,

első sejtosztódás

6–14

K3

0,4 M

1 mg/1 BAP,

0,1 mg/1 NAA

átoltás új táptalajba 10-szeres hígítással (fény)

fejlődő kolóniák

(50–70 sejtesek)

15–28

K3

0,2 M

0,5 mg/1 BAB,

0,05 mg/1 NAA

átoltás 5-szörös hígítással (fény)

1–2 mm-es, zöldes kolóniák

28–50

B5

0,8% agár

3% szaharóz

0,5 mg/1 BAP,

0,01 mg/1 NAA

kolóniák átoltása agár táptalajra (fény)

hajtásprimordia

40–60

MS

0,8% agár

2% szaharóz

0,1 mg/1 BAP, vagy hormonmentes

fejlődő hajtások

áthelyezése

új táptalajra

zöld hajtások, gyökérkezdemények

60-tól

MS

0,8% agár

2% szaharóz

hormonmentes

fejlődő hajtások áthelyezése új táptalajra

10-15 naponként

gyökeres növénykék


Táptalajok és oldatok
  1. Sejtfalbontó enzimoldat: 0,7% celluláz és 0,25% macerozim (Sigma) 0,4 M szaharóz-tartalmú K3 táptalajban.

  2. K3-as táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3; 250 mg/l NH4NO3; 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O; 300 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 150 mg/l NaH2PO4 × H2O; 134 mg/l (NH4)2SO4; 50 mg/l CaHPO4; 27,8 mg/l FeSO4 × H2O; 37,3 mg/l Na2EDTA. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × 4 H2O; 3 mg/l H3BO3; 0,75 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O. Vitaminok: 10 mg/l tiamin-HCl; 1 mg/l piridoxin-HCl; 1 mg/l nikotinsav; 100 mg/l inozit. Cukrok: 250 mg/l xilóz; 0,4 M szaharóz (protoplaszt-izoláláshoz); 0,4 M glükóz (sejtkultúrához). Hormonok: lásd 33. táblázat.

  3. B5 táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3, 150 mg/l CaCl2 × 2 H2O, 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O, 134 mg/l (NH4)2SO4, 150 mg/l NaH2PO4 × H2O. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × H2O, 3 mg/l H3BO3, 0,75 mg/l KI, 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O, 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O, 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O, 13,2 mg/l MnSO4 × H2O, 27,8 mg/l FeSO4 × 7 H2O, 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O. Vitaminok:1 mg/l nikotinsav, 1 mg/l piridoxin HCl, 10 mg/l tiamin HCl, 100 mg/l mio-inozit. Hormonok: lásd 33. táblázat.

  4. W5 ozmotikum: 9000 mg/l NaCl, 18 400 mg/l CaCl2 × H2O, 400 mg/l KCl, 1000 mg/l glükóz (pH 5,8).

A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságai

A Solanum brevidens, nem gumóképző vad burgonyafaj egyes származékai ellenállóak a különböző burgonyavírusokkal [burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll luteovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus)] szemben (Jones, 1979; Austin et al., 1985; Horváth et al., 1987; Gibson et al., 1988, 1990; Pehu et al., 1990; Fehér et al., 1990; Valkonen et al., 1991, 1992, 1995; Horváth et al., 1993, 1996). A S. brevidens ivaros úton nem keresztezhető a Solanum tuberosum kultúrnövény fajtáival. A két faj protoplasztfúzióval előállított vegetatív sejthibridjeiből életképes, gumóval rendelkező fajhibridek nevelhetők fel (Austin et al., 1985; Gibson et al., 1988; Fehér et al., 1990; Pehu et al., 1990). A vegetatív hibridek még természetesen nem rendelkeznek a kultúrburgonya-fajták összes jó tulajdonságával, de már alkalmasak arra, hogy további keresztezési partnerek legyenek és új, vírusnak ellenálló burgonyafajtákat lehessen belőlük előállítani (Dudits és Heszky, 1990).

Austin et al. (1985) után Helgeson (1992) szintén a S. brevidens (PI 218228) és a S. tuberosum (PI 203900) származékaival állított elő sejthibrideket. A S. brevidens fenti származéka fertilis diploid, és rezisztens a burgonya levélsodródás vírussal szemben, viszont rendkívül fogékony a Phytophthora infestans 0 és 4-es rasszára. A S. tuberosum fenti származéka tetraploid, és fogékony a burgonya levélsodródás vírusra, valamint a P. infestans 4-es rasszára, viszont rezisztens a gomba 0 rasszával szemben. A szomatikus hibridizáció olyan fertilis hibrideket eredményezett, amelyek mindkét szülő rezisztenciáját magukban foglalták. A rezisztencia a szexuális úton létrejövő utódokban is megnyilvánult, és a gumók minőségében is javulás következett be.