Ugrás a tartalomhoz

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek

dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Mezőgazda Kiadó

A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba

A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba

A rezisztenciagének forrásától (például természetes rezisztenciagének, vírusgének, „öngyilkos” gének) függetlenül szükség van azok bevitelére a növényi genomba. Ezt az eljárást növénytranszformációnak nevezzük, mivel általa örökíthető módon új tulajdonságot lehet bevinni a növénybe. A transzformációs módszerek két csoportba sorolhatók: 1. indirekt transzformáció és 2. direkt transzformáció. Amennyiben a génbevitel hordozó (vektor) organizmus alkalmazásával történik, indirekt transzformációról beszélünk. Direkt transzformáció során a DNS passzív módon (mechanikai, kémiai úton vagy elektroporációval) jut a sejtbe. E sejtekből azután egész növényeket regenerálnak, melyekben tehát a sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt DNS-szekvenciát. A növénytranszformálás előfeltétele a jól működő regenerációs rendszer, amelynek segítségével növényegyedek állíthatók elő.

Az agrobaktériumos transzformálás

A kétszikűeknél a legáltalánosabb, de újabban az egyszikű növényeknél is megjelent az Agrobacterium tumefaciens (illetve az Agrobacterium rhizogenes) vektor felhasználásával történő génbevitel. Ezek a Gram-negatív talajbaktériumok a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik és tumorokat okoznak rajtuk. A baktériumok patogenitása öszszefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével. A Ti plazmid egy része (transzfer DNS = T-DNS) a kórfolyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába integrálódik (Süle, 1985; Filippone és Penza, 1992). A T-DNS régióban helyezkednek el a tumorok kialakulásáért felelős gének, míg a T-DNS átvitelét szabályozó gének mindvégig a baktériumsejtben lokalizáltak. Ha a tumorindukálók helyére más géneket építenek be, azok éppúgy integrálódnak a növényi genomba. E rendszer felhasználásával a növények gyakorlatilag bármely génnel transzformálhatók (109. ábra).

109. ábra - A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar, 1996 után]

A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar, 1996 után]


A T-DNS szakaszt hordozó plazmidot, amelybe a kívánt gén egyszerűen beépíthető, klónozó plazmidnak nevezik. A növénytranszformálás gyakorlatában a T-DNS a következő régiókat tartalmazza (110. ábra):

  1. Szelekciós marker gén (antibiotikum- vagy herbicid-rezisztenciagén) megfelelő promóter és terminációs régiók között, melyek a gén működését, expresszióját (kifejeződését) teszik lehetővé.

  2. A hasznos gén (például rezisztenciagén, vírus-cDNS-szekvencia) szintén promóter- és terminációs régió között.

  3. Határoló régiók. Ezek a T-DNS „jobb és bal oldali” végei, amelyek a szakasz integrálódásához nélkülözhetetlenek.

110. ábra - A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus – CMV) Trk7-es törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP) hordozza, az ábrán jelölt XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé. BR = (right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal oldali határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és terminál régió között; Tet = tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött

A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus – CMV) Trk7-es törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP) hordozza, az ábrán jelölt XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé. BR = (right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal oldali határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és terminál régió között; Tet = tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött


A marker gén (leggyakrabban a kanamicinrezisztenciát eredményező neomicin-foszfotranszferáz gén-nptII) bevitele azért szükséges, hogy segítségével a regenerálás során a transzformáns növények szelektálhatók legyenek. A növénytranszformálás folyamán alkalmazott lépések növényi rendszerenként eltérőek. Az általános lépések azonban a következők:

A klónozó plazmidot (rajta a beépíteni kívánt génnel) tartalmazó Agrobacterium sejteket egy éjszakán keresztül folyékony táptalajban fölszaporítják. A plazmidok hordoznak olyan antibiotikum-rezisztenciagéneket is, amelyek baktériumpromóter mögött vannak. Így, ha a folyékony táptalajhoz megfelelő antibiotikumot is adnak, akkor csak azok a sejtek szaporodnak föl, amelyek a kívánt plazmidot tartalmazzák. Ebbe a baktériumszuszpenzióba mártják néhány másodpercre a megsebzett levél- vagy szárrészt. Ekkor megy végbe az Agrobacterium fertőzés és a génátvitel. Ezt az explantumot aztán szilárd regeneráló táptalajra helyezik, ahol megindul a kalluszképződés, majd a hajtásregenerálás. A gyökérregeneráláshoz a fiatal hajtásokat általában gyökereztető táptalajra helyezik. Ez már kétféle antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalaj. Az egyik antibiotikum az augmentin, vagy cefotaxim, mely a növénykék felületén esetleg átvitt Agrobacterium sejteket pusztítja el, a másik a T-DNS-en bevitt marker génnek megfelelő antibiotikum (általában kanamicin), melynek hatására csak a transzformáns (a marker gént, tehát a T-DNS-t hordozó és expresszáló) hajtások gyökereznek meg.

A fentiekben csupán nagy vonalakban ismertettük a rutinszerű dohánytranszformálás főbb lépéseit. Sok esetben például nem differenciálódott levélszöveteket, hanem kalluszt transzformálnak, és a kalluszsejteket órákig együtt tenyésztik az Agrobacterium sejtekkel. Többszöri átoltási lépések után organo- vagy embriogenezis útján regenerálják az utódnövényeket. Az agrobaktériumos transzformálásban egységes protokoll nincs, a tenyésztési lépések növényfajoktól és -fajtáktól, valamint laboratóriumoktól függően mások és mások.

A burgonyanövények (Solanum tuberosum) transzformálása (Dietze et al., 1995)

  1. Transzformálásra alkalmas növények előállítása. Vírusmentes steril növények 15-15 mm-es hajtáscsúcsait 90 ml 2MS (0,7% Bitec agar, Difco) táptalajra oltjuk félliteres befőttesüvegekben. Négy héttel később 5–6 db, sötétzöld levelet gyűjtünk be.

  2. Az Agrobacterium tumefaciens-t 5 ml (a vektorplazmidnak megfelelő antibiotikumot tartalmazó) YEB táptalajba oltjuk le 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban, és egy éjszakán át 28 °C-on rázatjuk (130 rpm).

  3. A leveleket üres Petri-csészébe helyezzük, levágjuk a levélalapi részt és egy éles zsilettpengével két, 1–2 mm hosszúságú vágást végzünk egymástól 4–5 mm távolságra úgy, hogy a vágások keresztezzék a levél főerét.

  4. Tíz ilyen levelet fonákával fölfelé 10 ml 2 MS (folyékony) táptalajt tartalmazó Petri-csészébe, a tápoldat felszínére helyezünk, anélkül hogy a leveleket alámerítenénk. Ehhez 50 μl késői, logaritmikus fázisban lévő Agrobacterium kultúrát adunk, és az elegyet óvatosan összekeverjük. A Petri-csészét két napra 22–24 °C-ra helyezzük.

  5. A leveleket fonákukkal lefelé kallusz-indukáló táptalajra (CIM) tesszük úgy, hogy a teljes levélfelület érintkezzen a táptalajjal. A vágási helyeken először kisméretű kalluszok jelennek meg.

  6. Hét nap elteltével a leveleket hajtás-indukáló táptalajra helyezzük (SIM), ahol megjelennek az első hajtások.

  7. Amikor a hajtások elérték az 1–1,5 cm-es hosszúságot, azokat gyökereztető táptalajra (RIM) helyezzük át. Ehhez a lépéshez célszerű 250 ml-es, 70 ml táptalaj tartalmú üveget használni. Három vagy négy héttel később a gyökerekkel és levelekkel rendelkező növénykék tovább szaporíthatók, illetve üvegházba ültethetők.

Dietze et al. (1995) a szövettenyésztés során a 16 órai megvilágítást követően 22 óráig tartó sötét periódust és 3000 lux fényintenzitást alkalmaztak. A transzformáns növényekre a kallusz-indukáló (CIM) és a hajtás-indukáló (SIM) táptalajon a riporter génnek megfelelő antibiotikummal (kanamicin vagy higromicin stb.) szelektáltak. Az itt ismertetett eljárás segítségével levelenként két-három transzformáns regenerálható.

Táptalajok

  1. YEB: 0,1% élesztőextraktum; 0,5% marhahúsextraktum; 0,5% pepton; 0,5% szaharóz; 0,49 g/l MgSO4 × H2O. A megfelelő antibiotikumot sterilezés után a már szobahőmérsékletre lehűlt táptalajhoz adjuk.

  2. MS táptalaj: Makroelemek: 1650 mg/l NH4NO3; 1900 mg/l KNO3; 440 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 370 mg/l MgSO4 × 7 H2O; 170 mg/l KH2PO4. Mikroelemek: 6,2 mg/l H3BO3; 16,9 mg/l MnSO4 × H2O; 10,6 mg/l ZnSO4 × 7 H2O; 0,83 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O; 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O; 27,5 mg/l FeSO4 × 7 H2O. Vitaminok: 0,5 mg/l nikotinsav; 0,5 mg/l piridoxin HCl; 0,1 mg/l tiamin HCl; 2,0 mg/l glicin; 100 mg/l mio-inozit. Szilárd táptalaj esetén szükséges még 0,7% agar hozzáadása. A táptalaj pH-ját 5,7–5,8 értékre 1 M KOH-oldattal állítjuk be. A táptalaj sterilezése 121 °C-on 20 percig történik.

  3. Kallusz-indukáló táptalaj (CIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 5 mg/l naftolecetsav (NAA); 0,1 mg/l benzilaminopurin (BAP); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kanamicin vagy 1 mg/l higromicin.

  4. Hajtás-indukáló táptalaj (SIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 2 mg/l zeatin; 0,02 mg/l naftilecetsav (NAA); 0,002 mg/l gibberellinsav (GA3); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kamicin vagy higromicin.

  5. Gyökereztető táptalaj (RIM): MS táptalaj; 250 mg/l klaforán.

DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussal

Az Agrobacterium segítségével végzett növénytranszformálás az egyszikű növényeknél általában nem alkalmazható. Alternatív eljárás a protoplasztok transzformálása polietilén-glikol- (PEG) oldatban. A PEG képes megbontani a sejtmembrán folyamatosságát, és a keletkező pórusokon a DNS passzív módon bejuthat a sejtbe, ahol a genomba integrálódhat. Makropórusok ugyanakkor elektromos impulzussal is létrehozhatók. Ez utóbbi módszerrel nemcsak protoplasztokba, hanem intakt növényi sejtekbe is képesek DNS-t juttatni. Ma mindkét eljárást széleskörűen alkalmazzák.

Génátvitel biolisztikus módszerrel

E módszer alkalmazható a legszélesebb körben intakt sejtek transzformációjára. A bejuttatni kívánt DNS-t 1–2 μm átmérőjű wolframrészecskékre rögzítik, majd ezeket nagy sebességre gyorsítják – általában nagynyomású He-, illetve N2 gázzal. A részecskék eltalálják a célszövetet, és behatolnak a részlegesen sérült sejtekbe. A részecskék felületén bevitt DNS azután integrálódhat a növény genomjába.

A „génpuskával” történő növénytranszformálás valójában óriási előrelépést jelentett a transzgénikus növények előállításában, mivel számos gazdaságilag jelentős fajta transzformációját tette lehetővé.

A biotechnológia mint új és hatékony eszköz

Az elmúlt évtized biológiai, biokémiai és molekuláris biológiai felfedezései egyre közelebb vitték az emberiséget ahhoz, hogy az egyes szervezetek működését ellenőrző géneket megismerjék és az adott keretek között szinte korlátlan módon megváltoztassák. A génsebészet, ill. a génátültetés módszereinek felhasználásával forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben is (Balázs és Gáborjányi, 1984; Monti, 1992a, b). 1998-ban a transzgénikus növényfajták termesztési területe csaknem elérte a 40 millió hektárt. Ewe (1998) szerint 1-2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a transzgénikus növény lesz. A tendenciára jellemző, hogy az Amerikai Egyesült Államokban 2154, Japánban 2055, Németországban 629 géntechnológiai úton előállított növényre jelentettek be szabadalmat (Janositz, 1998).

Új, transzgénikus fajták termesztésbe vétele azonban bizonyos kockázatokkal is jár. Vírusellenálló növények esetében ezek sokkal kevésbé egészségügyi, mint inkább ökológiai jellegű kockázatok (Bartsch et al., 1996a, b; Parker és Bartsch, 1996; Bartsch és Pohl-Orf, 1996; Tepfer és Balázs, 1997). Rendkívül fontos ezért az ilyen fajták kontrollált engedélyezése és termesztésbe vétele. E rendelkezéseket Magyarországon a géntechnológiai tevékenységről szóló 1998. Évi XXVII. Törvény tartalmazza. Úgyszintén fontos feladat a nyilvánosság pontos tájékoztatása a biotechnológia eredményeiről a megalapozatlan félelmek eloszlatása érdekében (Jones, 1994; Deshayes, 1994; Balázs, 1997).